發(fā)布時(shí)間：2020-05-01 03:12

【摘要】：禽傷寒(fowl typhoid)是因感染雞傷寒沙門菌(.Salmonella Gallinarum)而導(dǎo)致的急性或慢性敗血性禽類傳染病,表現(xiàn)出腹瀉、厭食、精神不振等癥狀,給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。該病可通過(guò)藥物進(jìn)行治療,雖然減少了死亡,但長(zhǎng)期用藥會(huì)增加成本,易產(chǎn)生耐藥性,且愈后帶菌,因此,免疫接種仍是預(yù)防和控制該病的一個(gè)理想選擇。最先被用于控制禽傷寒的減毒活疫苗9R,能有效的抵抗雞傷寒沙門菌的感染,但其殘留的毒力仍有致病性。因此,研制一種安全有效的雞傷寒沙門菌減毒疫苗仍將十分必要。本研究利用自殺質(zhì)粒介導(dǎo)的同源重組技術(shù)構(gòu)建出雞傷寒沙門菌1009株的spiC基因缺失株1009ΔspiC,在此基礎(chǔ)上,運(yùn)用λ噬菌體同源重組系統(tǒng)進(jìn)一步敲除crp基因,構(gòu)建出雞傷寒沙門菌1009ΔspiCAcrp雙基因缺失株。PCR和測(cè)序鑒定結(jié)果表明,成功獲得雞傷寒沙門菌雙基因缺失株1009ΔspiCΔcrp。生物學(xué)特性研究結(jié)果顯示,1009株spiC和crp基因的缺失能夠得到穩(wěn)定的遺傳,缺失株部分生化特性發(fā)生了變化,生長(zhǎng)速度減慢,與野生株相比其對(duì)雛雞的LDso升高了107倍,表明雙基因的缺失使雞傷寒沙門菌1009ΔspiCΔcrp的毒力減弱。為評(píng)價(jià)1009ΔspiCΔcrp減毒株的安全性及保護(hù)效力,本實(shí)驗(yàn)采用肌肉注射的方式分別以1×105CFU、1×106CFU、1×107CFU的劑量對(duì)3日齡雛雞進(jìn)行初次免疫并于1周后再次免疫,同時(shí)對(duì)照組用PBS以相同方式進(jìn)行免疫。體重測(cè)定以及臨床觀察結(jié)果顯示其與對(duì)照組沒(méi)有差別,表明減毒株對(duì)雛雞的生長(zhǎng)沒(méi)有影響且不會(huì)出現(xiàn)副作用,細(xì)菌在肝臟和脾臟中短暫定殖后可被機(jī)體清除。血清IgG抗體水平和淋巴細(xì)胞增殖的檢測(cè)結(jié)果表明,肌肉注射免疫后減毒株誘導(dǎo)雛雞產(chǎn)生了良好的細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答。免疫后21天,攻毒保護(hù)效力結(jié)果顯示免疫組在攻毒后沒(méi)有出現(xiàn)臨床癥狀,免疫保護(hù)率為100%。另外,本研究以1009ΔspiCΔcrp減毒株口服免疫雛雞后,對(duì)減毒株的安全性和免疫效力進(jìn)行了初步研究。在對(duì)3日齡雛雞進(jìn)行口服免疫并于1周后進(jìn)行再次免疫后,免疫組雛雞體重增長(zhǎng)與對(duì)照沒(méi)有顯著差異；產(chǎn)生了較高的IgG抗體水平,并于初次免疫3周后達(dá)到最高且顯著高于對(duì)照組；IL-4、IL-6和IL-1p的表達(dá)水平也出現(xiàn)上調(diào)。在初次免疫后21天用強(qiáng)度株SG9攻毒后免疫組的保護(hù)率為100%,而對(duì)照組則為30%。同時(shí)組織病理切片也顯示,免疫組無(wú)病變而對(duì)照組臟器病變明顯。結(jié)果表明,1009ΔspicAcrp具有良好的安全性并能誘導(dǎo)雛雞產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答,是理想的防治雞傷寒的疫苗候選株,為實(shí)現(xiàn)在實(shí)際生產(chǎn)中使用疫苗來(lái)預(yù)防并控制雞傷寒奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

２．１雞傷寒沙口菌１０0９Ａｗｚ’ａＫｍＫ的篩選及鑒定逡逑挑取經(jīng)電轉(zhuǎn)化含有自殺質(zhì)粒的扔２１３邋（ＰＧＭＢ１５１－Ａ５內(nèi)Ｃ／＾Ｋ）單菌落，引物Ｗｚ’Ｃ－逡逑ＹＺ－Ｆ／民進(jìn)斤ＰＣＲ驗(yàn)證，擴(kuò)增出約２．０邋Ｉｃｂ的條帶（圖１－１），表明自殺質(zhì)粒ｐＧＭＢ１５１－逡逑Ａｗｚ’Ｃ／ＫｍＫ成功轉(zhuǎn)入的２１３，可做為供體菌與受體菌進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移。雞傷寒沙口菌１００９逡逑株與Ｘ７２１３邋（ＰＧＭＢ１５１－Ａ５知Ｃ／ＫｈｉＫ）混合培養(yǎng)進(jìn)行固相雜交，發(fā)生接合轉(zhuǎn)移后，重組質(zhì)逡逑粒ＰＧＭＢ１５１－Ａ卻Ｃ／ＫｍＫ的同源臂與染色體上如Ｃ基因的同源序列發(fā)生交換，將被整合逡逑到染色體上，此時(shí)重組菌存在ＷＺＣ的兩種拷貝形式，，即缺失型和野生型。因此，Ｗ上游逡逑內(nèi)部序列和下游內(nèi)部序列組成的驗(yàn)證引物Ｗ／Ｃ－ＹＺ－Ｆ／Ｒ進(jìn)行ＰＣ民驗(yàn)證，會(huì)擴(kuò)X棾雋教醮�，辶x咸醮笮》直鷦跡玻板澹耄夂停保板澹祝浚ㄍ跡保玻�。挑取接韩I(xiàn)蒲櫓ふ返木輳諼蓿危幔茫旌義希保埃ナ塹模蹋亂禾迮嘌寫寫嘌⒕剮隕稈『蠡竦茫保埃埃梗粒鰨茫耍恚巳卞義鮮е

本文編號(hào)：2646488