【摘要】：新城疫是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)強毒株引起的一種急性、烈性傳染性疾病。近年來,該病已成為危害鵪鶉養(yǎng)殖業(yè)的主要疫病之一。我國多個省份已有該病暴發(fā)和流行的報道,在經(jīng)濟上給鵪鶉養(yǎng)殖業(yè)造成重大的損失。本研究根據(jù)GenBank上發(fā)表的不同禽類Toll樣受體信號通路中部分固有免疫相關(guān)因子(TLR3、TLR7、IL-6、IL-8、IFNα、AvBD-9)及內(nèi)參基因(β-actin)的序列并參閱相關(guān)文獻報道,設(shè)計并合成7對特異性引物。利用合成的引物通過PCR方法擴增出目的片段,然后進行基因克隆,構(gòu)建質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品,建立檢測上述基因的熒光定量PCR方法(qRT-PCR),進行特異性和重復(fù)性試驗。結(jié)果表明,建立的TLR3、TLR7、IL-6、IL-8、IFNα、AvBD-9和β-actin實時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù)在0.99～1.00之間、擴增效率在1.83～2.13之間且溶解曲線在40個循環(huán)內(nèi)呈現(xiàn)單一溶解峰。重復(fù)性檢驗結(jié)果中各目的基因批內(nèi)和批間變異系數(shù)都小于4.0%,標(biāo)準(zhǔn)差小于0.5。上述結(jié)果證明建立的qRT-PCR檢測方法具有特異性強、穩(wěn)定性和可重復(fù)性高的特點,為定量分析鵪鶉固有免疫相關(guān)因子mRNA轉(zhuǎn)錄水平提供了技術(shù)支持。為探究不同基因型NDV對鵪鶉的致病性差異,本課題選用基因Ⅶ型GXQ53毒株、基因Ⅷ型GXGF12001毒株和基因Ⅸ型F48E8國內(nèi)參考毒株人工感染35日齡的非免疫鵪鶉,觀察、記錄試驗動物臨床癥狀并打分,在感染后5、8、11天觀察各試驗組鵪鶉的脾臟、大腦和盲腸扁桃體的病理學(xué)變化并記錄得分;采集組織樣品進行病理組織學(xué)觀察、病毒載量測定和0固有免疫相關(guān)因子基因表達量的測定。具體結(jié)果如下:(1)感染組均表現(xiàn)出典型的新城疫臨床癥狀和剖檢病變,其中F48E8組、GXGF12001組、GXQ53組臨床癥狀得分分別為12.0分、6.0分和6.0分,剖檢病變平均得分分別為3.0分、1.67分和1.83分。病理組織學(xué)檢測結(jié)果表明,F48E8、GXGF12001和GXQ53毒株對脾臟、盲腸扁桃體和腦均能產(chǎn)生不同程度的損傷,其中脾臟和盲腸扁桃體兩個免疫器官均表現(xiàn)出淋巴細胞減少、出現(xiàn)壞死灶,隨著感染時間增加F48E8組和GXGF12001組病變加劇,而GXQ53組有逐漸轉(zhuǎn)歸的跡象。而大腦的病變以小膠質(zhì)細胞增生為主,隨著時間推移病變都有加劇的趨勢。綜合病理組織結(jié)果來看,F48E8對免疫系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)的損傷能力比GXGF12001的強,而GXQ53組弱于前兩組。(2)試驗組鵪鶉的脾臟、盲腸扁桃體和大腦中病毒載量檢測結(jié)果表明,F48E8毒株和GXGF12001毒株不僅可在脾臟和盲腸扁桃體中復(fù)制,還可以通過血腦屏障浸染到大腦中。而GXQ53毒株只在盲腸扁桃體中復(fù)制。病毒拷貝數(shù)顯示脾臟中GXGF12001毒株的復(fù)制能力強于F48E8毒株,而F48E8毒株在腦中的復(fù)制能力強于GXGF12001毒株。盲腸扁桃體中復(fù)制能力強弱順序為:GXGF12001毒株F48E8毒株GXQ53毒株。(3)鵪鶉感染NDV后不同組織中固有免疫相關(guān)因子的相對表達量結(jié)果如下:TLR3、TLR7、IL-6、IL-8、IFNα、AvBD-9在脾臟、大腦和盲腸扁桃體中都有表達。其中,TLR3、IL-6和IL-8在脾臟中表達顯著上調(diào)(P0.05),盲腸扁桃體中TLR7、IL-8、AvBD-9和IL-6表達顯著上調(diào)(P0.05),腦中IFNα和AvBD-9顯著上調(diào)(P0.05),且這些組織中細胞因子的相對表達量與病毒的拷貝數(shù)趨于正相關(guān)。綜上所述,我們推測TLR3、TLR7、IL-6、IL-8、IFNα、AvBD-9可能參與鵪鶉對NDV感染的免疫反應(yīng)。本課題成功建立了檢測鵪鶉固有免疫相關(guān)因子TLR3、TLR7、IL-6、IL-8、IFNα、AvBD-9和內(nèi)參基因β-actin熒光定量方法;人工感染試驗表明基因Ⅶ型GXQ53毒株、基因Ⅷ型GXGF12001毒株和基因Ⅸ型F48E8毒株對非免疫鵪鶉具有組織嗜性,病毒可在脾臟、盲腸扁桃體和大腦中增殖并對這些組織器官造成損傷,且F48E8毒株的致病性強于GXGF12001毒株,而GXQ53毒株的致病性最弱,它們都能引起鵪鶉的發(fā)病死亡。由所檢測的細胞因子mRNA結(jié)果推測TLR3、TLR7、IL-8、IFNα在鵪鶉脾臟、腦和盲腸扁桃體中可能參與鵪鶉對新城疫病毒感染的免疫反應(yīng),而IL-6在脾臟和盲腸扁桃體中表達量顯著上調(diào),以及AvBD-9在腦中的表達量顯著上調(diào),可能與TLR7介導(dǎo)的MyD88依賴途徑以及TLR3介導(dǎo)的TRIF依賴途徑有關(guān)。
【圖文】：

路傳遞到下游引起ＩＲＦ７、ＮＫ－ｋＢ和ＡＰ－１信號通路激活，從而誘導(dǎo)炎性細胞因子的產(chǎn)生逡逑［６６］，如圖１－２。現(xiàn)今ＮＤＶ為僅次于禽流感病毒是養(yǎng)禽業(yè)的第二大疾病被作為重點研宄逡逑對象之一。關(guān)于ＴＬＲｓ在禽類感染ＮＤＶ后細胞因子的變化有一定的研究。逡逑Ｌｉ等研宄表明鴿子感染ＰＰＭＶ－１病毒后能夠引起部分先天性免疫相關(guān)因子的表達逡逑量發(fā)生上調(diào)，特別是ＴＬＲ３和ＴＬＲ７在多個組織器官中表達上調(diào)［６７］。逡逑Ｄｅｉｓｔ等研究發(fā)現(xiàn)雞感染ＮＤＶ后使用轉(zhuǎn)錄組的方法顯示感染后氣管中免疫細胞浸逡逑潤增加，ｉＣＯＳ－ｉＣＯＳＬ信號傳導(dǎo)，ＮＦ－ｋＢ信號傳導(dǎo)，先天免疫因子不同程度的表達［６８］。逡逑Ｒｕｅ等分別用毒力不同的Ｎ邋ＤＶ感染雞，發(fā)現(xiàn)強毒株可引起雞脾臟中的炎性因子逡逑（ＩＦＮａ、ＩＬ－６）表達上調(diào)，而弱毒株引起的變化不明顯逡逑徐倩倩等川鵝源新城疫感染鵝發(fā)現(xiàn)感染７２小時后病母復(fù)制與ＴＬＲ１－５和ＴＬＲ７、逡逑ＡｖＢＤ－４，６，１０和１２、ＭＨＣ邋Ｉ類、ＦＡＳ配體和ｉＮＯＳ的宿主ｍＲＮＡ表達之間呈正相關(guān)ｌ？］。逡逑７逡逑

以鵪鶉外周血獲得的ｃＤＮＡ為模板，使用合成的７對特異性引物按照２．２．２．３中的逡逑反應(yīng)體系和反應(yīng)程序進行ＰＣＲ擴增。用ＤＬ５００邋ＤＮＡ邋Ｍａｒｋｅｒ為參照與獲得的ＰＣＲ產(chǎn)物逡逑—同進行２．０％的瓊脂糖凝膠電泳，利用紫外凝膠成像儀查看擴增結(jié)果。結(jié)果（如圖２－１）逡逑表明獲得與預(yù)期大小相符的ＤＮＡ片段。逡逑Ｍ邋１邐２邐３邐４邐５邐６邐７逡逑圖２－１鶇鶉不同細胞因子的ＲＴ－ＰＣＲ擴增結(jié)果圖逡逑Ｆｉｇ．２－１邋Ｔｈｅ邋ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｏｆ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋Ｑｕａｉｌ邋ｃｙｔｏｋｉｎｅ邋ＲＴ－ＰＣＲ邋ｐｒｏｄｕｃｔｓ逡逑Ｍ：ＤＬ５００；邋ｌ：ｐ－ａｃｔｉｎ；邋２：ＴＬＲ３；邋３：ＴＬＲ７；邋４：邋ＩＦＮａ；邋５：ＡｖＢＤ－９；邋６：ＩＬ－８；邋７：ＩＬ－６；逡逑１５逡逑
【學(xué)位授予單位】：廣西大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S852.65

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本文編號：2645534