【摘要】：試驗(yàn)開展了犬C-反應(yīng)蛋白(C-CRP)熒光微球免疫層析定量方法的研究,旨在研制一種操作簡(jiǎn)易、靈敏度高,用于快速定量檢測(cè)C-CRP熒光免疫層析試紙條。采用雙抗體夾心法和熒光免疫層析技術(shù),以羧基熒光微球標(biāo)記的抗C-CRP單克隆抗體及羊抗雞IgY為標(biāo)記抗體,抗C-CRP單克隆抗體和雞IgY分別作為檢測(cè)線和質(zhì)控線制備熒光免疫層析試紙條。結(jié)果顯示,所制備C-CRP檢測(cè)試紙條的檢測(cè)范圍為0.5～250mg/L,檢測(cè)限為0.5mg/L,批內(nèi)和批間變異系數(shù)(CV)分別為0.68%～6.94%和0.89%～8.79%,平均回收率為98.15%～101.19%,試劑與9種干擾物質(zhì)無(wú)交叉反應(yīng)。加速破壞穩(wěn)定性試驗(yàn)表明試紙條可以常溫放置24個(gè)月。臨床樣本測(cè)試發(fā)現(xiàn),其與I-CHROMA試劑盒檢測(cè)結(jié)果相關(guān)性良好(R2=0.995)。綜上所述,該熒光免疫層析試紙條靈敏度、特異度較高,且操作簡(jiǎn)單、快速,可用于寵物犬臨床檢測(cè)。
【圖文】：

ＨＲＯＭＡ）試劑盒檢測(cè)２３３例犬隨機(jī)血液樣本，�。泊沃貜�(fù)的平均值，比較檢測(cè)結(jié)果相關(guān)性。２結(jié)果２．１抗體標(biāo)記濃度對(duì)微球熒光強(qiáng)度的影響濃度為０．０１ｍｇ／ｍＬ不同標(biāo)記量的熒光微球經(jīng)熒光光譜儀連續(xù)掃描，最大激發(fā)波長(zhǎng)為４６９ｎｍ，最大發(fā)射波長(zhǎng)為５２７ｎｍ，說(shuō)明微球在檢測(cè)時(shí)激發(fā)光和發(fā)射光更容易分開，降低了背景干擾的幾率。原熒光微球和偶聯(lián)抗體濃度為０、０．２、０．４、０．６、０．８、１．０ｍｇ／Ｌ的免疫熒光微球發(fā)射光譜見圖１。由圖１可知，熒光微球偶聯(lián)不同濃度的抗體發(fā)射光譜的峰型規(guī)則，與偶聯(lián)前有相同的峰位，發(fā)射譜峰未見偏移，熒光強(qiáng)度未有明顯的降低。表明熒光微球的發(fā)射光譜的位置與抗體的標(biāo)記量無(wú)關(guān)，偶聯(lián)過(guò)程中微球光學(xué)性質(zhì)基本沒(méi)有改變。但熒光微球偶聯(lián)過(guò)程中，可能會(huì)有損失，造成熒光微球光學(xué)強(qiáng)度略微下降，且隨著偶聯(lián)抗體量的增加，熒光微球光學(xué)強(qiáng)度也會(huì)稍微降低。圖１不同抗體濃度標(biāo)記微球的熒光強(qiáng)度Ｆｉｇ．１Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｎｔｅｎｓｉｔｙｏｆｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓｌａｂｅｌｅｄｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｎｔｉｂｏｄｙｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ２．２熒光微球掃描電鏡圖譜熒光微球的掃描電鏡圖譜見圖２。由圖２可知，微球粒度均一，并且偶聯(lián)抗體后未引起微球的團(tuán)聚。免疫熒光微球表面有明顯的蛋白分子層，呈均勻分散狀態(tài)，表明抗體標(biāo)記效果良好。３２６

中國(guó)畜牧獸醫(yī)４６卷Ａ，原熒光微球；Ｂ，免疫熒光微球Ａ，Ｏｒｉｇｉｎａｌｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ；Ｂ，Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ圖２免疫熒光微球掃描電鏡圖譜（１００００×）Ｆｉｇ．２Ｔｈｅｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙｍａｐｐｉｎｇｏｆｔｈｅｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ（１００００×）２．３Ｃ－ＣＲＰ熒光定量免疫層析試紙條的標(biāo)準(zhǔn)曲線依次測(cè)定濃度為０、２．５、６、１５、２０、４８、１００、２５０ｍｇ／Ｌ的標(biāo)準(zhǔn)品Ｔ／Ｃ值，重復(fù)１０次，以熒光信號(hào)Ｔ／Ｃ值為Ｙ軸，標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)值為Ｘ軸擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，，結(jié)果見圖３。由圖３可知，Ｃ－ＣＲＰ標(biāo)準(zhǔn)方程為：Ｙ＝１．１００８３－０．２４９１６Ｘ＋１．０４５１Ｘ２（Ｒ２＝０．９９９７），曲線擬合度較好。２．４檢測(cè)范圍及靈敏度將濃度為０的標(biāo)準(zhǔn)品１０次測(cè)定的熒光值均值加２倍標(biāo)準(zhǔn)偏差代入Ｙ＝１．１００８３－０．２４９１６Ｘ＋１．０４５１Ｘ２（Ｒ２＝０．９９９７）中，得到試劑盒檢測(cè)限為０．５ｍｇ／Ｌ，試劑分析靈敏度較高，試劑檢測(cè)范圍為０．５～２５０ｍｇ／Ｌ。２．５精密度抽�。矀�(gè)批次的Ｃ－ＣＲＰ檢測(cè)試劑，分別對(duì)Ｃ－ＣＲＰ濃度為５、５０、２５０ｍｇ／Ｌ標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表１。由表１可知，批內(nèi)和批間變異系數(shù)分別為０．６８％～６．９４％和０．８９％～８．７９％，批內(nèi)與批間各檢測(cè)濃度變異系

【參考文獻(xiàn)】

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【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2643911