【摘要】：玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)是一種具有類雌激素特征的鐮刀菌次生代謝產(chǎn)物。ZEN在谷類作物中的污染十分普遍,其在谷類農(nóng)產(chǎn)品中的殘留對(duì)動(dòng)物造成了巨大的危害。在ZEN脫毒策略中,物理和化學(xué)方法在生產(chǎn)成本、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和適口性方面存在一定的限制。近年來(lái),生物脫毒法因其特異性高、脫毒效率高、脫毒后的產(chǎn)物無(wú)毒等優(yōu)點(diǎn),已經(jīng)成為ZEN脫毒的研究熱點(diǎn)。本研究旨在尋找一種能夠高效降解ZEN的菌株,探討其對(duì)ZEN的降解特性、降解產(chǎn)物及降解機(jī)制,并通過(guò)動(dòng)物安全性試驗(yàn)評(píng)估降解菌株飼用的潛在價(jià)值。論文主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:試驗(yàn)一ZEN高效降解菌株的篩選和鑒定以ZEN作為唯一碳源,通過(guò)HPLC檢測(cè)從土壤中篩選出9株對(duì)ZEN的降解率在50%以上的菌株,最終選取在LB培養(yǎng)基中發(fā)酵3d對(duì)ZEN(7.45μg/mL)的降解率高達(dá)100%的A2菌株。通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察和16S rRNA基因序列比對(duì)分析顯示A2菌株是Bacillus velezensis。試驗(yàn)二Bacillus velezensis A2對(duì)飼料中ZEN的脫毒效果及其對(duì)ZEN降解產(chǎn)物的初探150g ZEN(60mg/kg)污染飼料與150mL無(wú)菌蒸餾水混合接入5mL培養(yǎng)24h的A2菌株,在恒溫震蕩器內(nèi)以150rpm、37℃孵育5d(發(fā)酵過(guò)程中ZEN濃度為60μg/mL),經(jīng)HPLC檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)無(wú)ZEN的殘留。結(jié)果表明Bacillus velezensis A2同樣適用于飼料中ZEN的發(fā)酵脫毒。將培養(yǎng)24h的A2菌株發(fā)酵液的不同成分分別與ZEN共同孵育48h,通過(guò)HPLC定位A2菌株降解ZEN的功能物質(zhì);將PBS重懸的A2菌體與ZEN共同孵育,收集不同時(shí)間段的孵育樣品,使用Agilent 1100 Series LC/MSD Trap系統(tǒng)分析ZEN降解產(chǎn)物。結(jié)果顯示,菌株胞外液、胞內(nèi)液及活菌體對(duì)ZEN脫毒作用較強(qiáng),而滅活菌株沒(méi)有作用;同時(shí)檢測(cè)到分子量m/z=295.0[292+3H]~+的ZEN內(nèi)酯環(huán)水解脫羧產(chǎn)物。該試驗(yàn)初步的研究結(jié)果證明,Bacillus velezensis A2分泌的活性物能夠有效降解ZEN,ZEN內(nèi)酯環(huán)水解脫羧是其主要脫毒機(jī)制。試驗(yàn)三評(píng)估Bacillus velezensis A2在ZEN脫毒過(guò)程中的安全性將昆明小鼠(n=40)隨機(jī)分配到對(duì)照組(K)、ZEN毒素組(ZEN)、A2菌株組(A2)和解毒組(A2+ZEN)。用A2菌株的LB發(fā)酵液作為ZEN(ZEN 40mg/kg BW)解毒劑管飼小鼠。試驗(yàn)周期為28d,試驗(yàn)結(jié)束后,收集血液、臟器組織做相應(yīng)的檢測(cè)。組織病理學(xué)分析結(jié)果顯示,A2發(fā)酵液的口服管飼降低了由ZEN誘導(dǎo)的腎臟損傷程度;試劑盒檢測(cè)結(jié)果顯示,A2發(fā)酵液還大大降低了ZEN所引起肌酐(CRE)、尿酸(UA)和尿素氮(BUN)血清水平的增加。另外,A2發(fā)酵液的管飼逆轉(zhuǎn)了由ZEN誘導(dǎo)的腎組織中總超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)活性的降低,以及超氧化物歧化酶(MDA)含量的增加;RT-PCR和Western Blot分析結(jié)果表明,ZEN的飲食不僅提高了小鼠腎組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激關(guān)鍵基因BiP相關(guān)mRNA和蛋白的表達(dá)量(p0.05),還提高了促凋亡基因JNK、Caspase-12、CHOP相關(guān)mRNA和蛋白的表達(dá)量(p0.05)。此外,ZEN的飲食使得小鼠腎臟中抑凋亡基因Bcl-2相關(guān)mRNA和蛋白的表達(dá)量顯著降低,同時(shí)誘導(dǎo)了P-JNK和Anti-DDIT3蛋白的表達(dá)。然而,A2發(fā)酵液的管飼顯著逆轉(zhuǎn)了這些基因在腎組織中的異常表達(dá)。該試驗(yàn)結(jié)果證明,口服Bacillus velezensis A2發(fā)酵液能夠緩解ZEN對(duì)小鼠腎臟的氧化損傷和細(xì)胞凋亡。結(jié)論:本試驗(yàn)篩選出的Bacillus velezensis A2是一株未被發(fā)表的ZEN降解菌,該菌分泌的活性物質(zhì)催化ZEN內(nèi)酯環(huán)水解脫羧是其主要降解機(jī)制,且該菌株發(fā)酵液的口服能夠緩解ZEN對(duì)小鼠腎臟的損傷作用。Bacillus velezensis A2用于霉菌毒素脫毒具有較好的開(kāi)發(fā)潛力。
【圖文】：

圖 1-1 玉米赤霉烯酮及其衍生物的結(jié)構(gòu)式Fig.1-1 Structural formulas of zearalenone and its derivatives赤霉烯酮在體內(nèi)的吸收代謝被動(dòng)物攝入體內(nèi)后，會(huì)被腸道微生物及胃腸黏膜細(xì)胞進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化源性物質(zhì)結(jié)合，然后通過(guò)血液運(yùn)輸?shù)綑C(jī)體各處。經(jīng)放射性標(biāo)記法收代謝類似的是，ZEN 也要經(jīng)過(guò)腸-肝循環(huán)，ZEN 的代謝主要發(fā)、睪丸等具有雌激素靶器官的組織中。研究發(fā)現(xiàn)，在胃腸道內(nèi)代謝產(chǎn)物可以附著在未消化的飼料纖維上，以糞便形式排出體外；乳動(dòng)物排出的乳汁和尿液中（Dong M, et al，2010；Ji J, et al，20要有兩種代謝途徑：一種是吸收后的 ZEN 在體內(nèi)被 3α-/3β-羥基生成玉米赤霉烯醇（包括α-、β-ZOL），并進(jìn)一步催化還原成玉米EL），這些代謝產(chǎn)物都具雌激素樣作用效果（Kowalska K, et al，ZEN 及其衍生物通過(guò)與動(dòng)物體內(nèi)的二磷酸尿苷葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶或?yàn)闊o(wú)毒的葡萄糖醛酸和硫酸鹽的代謝物（Binder SB, et al，2017；

第二章 玉米赤霉烯酮高效降解菌 A2 的分離和鑒定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的完整性，并將完整的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海AST比對(duì)分析，根據(jù)比對(duì)結(jié)果從Gen Bank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載的公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)序列，，使用DNAStar把下載菌株序列和測(cè)試菌lustal W構(gòu)建菌株的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)及同源性矩陣圖。與分析曲線繪制結(jié)果曲線如圖2-1所示，ZEN的濃度在0.391~25.0μg/mL范圍內(nèi)呈004x-0.2033，相關(guān)系數(shù)為R2=0.9999。
【學(xué)位授予單位】：沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S859.8

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本文編號(hào)：2641750