【摘要】：玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)是一種具有類雌激素特征的鐮刀菌次生代謝產物。ZEN在谷類作物中的污染十分普遍,其在谷類農產品中的殘留對動物造成了巨大的危害。在ZEN脫毒策略中,物理和化學方法在生產成本、營養(yǎng)價值和適口性方面存在一定的限制。近年來,生物脫毒法因其特異性高、脫毒效率高、脫毒后的產物無毒等優(yōu)點,已經成為ZEN脫毒的研究熱點。本研究旨在尋找一種能夠高效降解ZEN的菌株,探討其對ZEN的降解特性、降解產物及降解機制,并通過動物安全性試驗評估降解菌株飼用的潛在價值。論文主要研究內容和結果如下:試驗一ZEN高效降解菌株的篩選和鑒定以ZEN作為唯一碳源,通過HPLC檢測從土壤中篩選出9株對ZEN的降解率在50%以上的菌株,最終選取在LB培養(yǎng)基中發(fā)酵3d對ZEN(7.45μg/mL)的降解率高達100%的A2菌株。通過形態(tài)學觀察和16S rRNA基因序列比對分析顯示A2菌株是Bacillus velezensis。試驗二Bacillus velezensis A2對飼料中ZEN的脫毒效果及其對ZEN降解產物的初探150g ZEN(60mg/kg)污染飼料與150mL無菌蒸餾水混合接入5mL培養(yǎng)24h的A2菌株,在恒溫震蕩器內以150rpm、37℃孵育5d(發(fā)酵過程中ZEN濃度為60μg/mL),經HPLC檢測后發(fā)現無ZEN的殘留。結果表明Bacillus velezensis A2同樣適用于飼料中ZEN的發(fā)酵脫毒。將培養(yǎng)24h的A2菌株發(fā)酵液的不同成分分別與ZEN共同孵育48h,通過HPLC定位A2菌株降解ZEN的功能物質;將PBS重懸的A2菌體與ZEN共同孵育,收集不同時間段的孵育樣品,使用Agilent 1100 Series LC/MSD Trap系統(tǒng)分析ZEN降解產物。結果顯示,菌株胞外液、胞內液及活菌體對ZEN脫毒作用較強,而滅活菌株沒有作用;同時檢測到分子量m/z=295.0[292+3H]~+的ZEN內酯環(huán)水解脫羧產物。該試驗初步的研究結果證明,Bacillus velezensis A2分泌的活性物能夠有效降解ZEN,ZEN內酯環(huán)水解脫羧是其主要脫毒機制。試驗三評估Bacillus velezensis A2在ZEN脫毒過程中的安全性將昆明小鼠(n=40)隨機分配到對照組(K)、ZEN毒素組(ZEN)、A2菌株組(A2)和解毒組(A2+ZEN)。用A2菌株的LB發(fā)酵液作為ZEN(ZEN 40mg/kg BW)解毒劑管飼小鼠。試驗周期為28d,試驗結束后,收集血液、臟器組織做相應的檢測。組織病理學分析結果顯示,A2發(fā)酵液的口服管飼降低了由ZEN誘導的腎臟損傷程度;試劑盒檢測結果顯示,A2發(fā)酵液還大大降低了ZEN所引起肌酐(CRE)、尿酸(UA)和尿素氮(BUN)血清水平的增加。另外,A2發(fā)酵液的管飼逆轉了由ZEN誘導的腎組織中總超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性的降低,以及超氧化物歧化酶(MDA)含量的增加;RT-PCR和Western Blot分析結果表明,ZEN的飲食不僅提高了小鼠腎組織中內質網應激關鍵基因BiP相關mRNA和蛋白的表達量(p0.05),還提高了促凋亡基因JNK、Caspase-12、CHOP相關mRNA和蛋白的表達量(p0.05)。此外,ZEN的飲食使得小鼠腎臟中抑凋亡基因Bcl-2相關mRNA和蛋白的表達量顯著降低,同時誘導了P-JNK和Anti-DDIT3蛋白的表達。然而,A2發(fā)酵液的管飼顯著逆轉了這些基因在腎組織中的異常表達。該試驗結果證明,口服Bacillus velezensis A2發(fā)酵液能夠緩解ZEN對小鼠腎臟的氧化損傷和細胞凋亡。結論:本試驗篩選出的Bacillus velezensis A2是一株未被發(fā)表的ZEN降解菌,該菌分泌的活性物質催化ZEN內酯環(huán)水解脫羧是其主要降解機制,且該菌株發(fā)酵液的口服能夠緩解ZEN對小鼠腎臟的損傷作用。Bacillus velezensis A2用于霉菌毒素脫毒具有較好的開發(fā)潛力。
【圖文】：

圖 1-1 玉米赤霉烯酮及其衍生物的結構式Fig.1-1 Structural formulas of zearalenone and its derivatives赤霉烯酮在體內的吸收代謝被動物攝入體內后，會被腸道微生物及胃腸黏膜細胞進行生物轉化源性物質結合，然后通過血液運輸到機體各處。經放射性標記法收代謝類似的是，ZEN 也要經過腸-肝循環(huán)，ZEN 的代謝主要發(fā)、睪丸等具有雌激素靶器官的組織中。研究發(fā)現，在胃腸道內代謝產物可以附著在未消化的飼料纖維上，以糞便形式排出體外；乳動物排出的乳汁和尿液中（Dong M, et al，2010；Ji J, et al，20要有兩種代謝途徑：一種是吸收后的 ZEN 在體內被 3α-/3β-羥基生成玉米赤霉烯醇（包括α-、β-ZOL），并進一步催化還原成玉米EL），這些代謝產物都具雌激素樣作用效果（Kowalska K, et al，ZEN 及其衍生物通過與動物體內的二磷酸尿苷葡萄糖苷轉移酶或為無毒的葡萄糖醛酸和硫酸鹽的代謝物（Binder SB, et al，2017；

第二章 玉米赤霉烯酮高效降解菌 A2 的分離和鑒定PCR擴增產物的完整性，并將完整的PCR擴增產物送至上海AST比對分析，根據比對結果從Gen Bank數據庫中下載的公認標準序列，，使用DNAStar把下載菌株序列和測試菌lustal W構建菌株的系統(tǒng)發(fā)生樹及同源性矩陣圖。與分析曲線繪制結果曲線如圖2-1所示，ZEN的濃度在0.391~25.0μg/mL范圍內呈004x-0.2033，相關系數為R2=0.9999。
【學位授予單位】：沈陽農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S859.8

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本文編號：2641750