發(fā)布時間：2020-04-26 15:22

【摘要】：脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON),又叫嘔吐毒素,主要是由禾谷鐮刀菌產生的一種霉菌毒素,世界范圍內均有檢出,廣泛污染玉米、大麥、小麥等農產品及其制品。目前,對DON神經毒性的研究主要集中在神經細胞凋亡和組織壞死方面,而關于DON引起的神經損傷中是否有自噬的參與以及自噬的作用尚未見相關報道。本試驗以PC12細胞作為研究對象,以不同濃度DON(0、125、250、500、1 000和2 000 ng/mL)處理24 h后,采用倒置顯微鏡、透射電鏡、吖啶橙(acridine orange,AO)染色、單丹磺酰尸胺(monodansylcadaverin,MDC)染色和流式細胞術、GFP LC3質粒轉染以及免疫熒光、熒光定量PCR、Western-blot等技術,研究DON對PC12細胞形態(tài)和超微結構、自噬泡、細胞凋亡率、LC3聚點率及自噬相關基因和蛋白Ⅲ型磷脂酰肌醇3磷酸激酶(the class phosphatidylinositol 3Ⅲ-kinase,class PI3KⅢ)、人抑癌基因(Beclin-1)、B細胞淋巴瘤/白血病-2基因(B-cell lymphoma 2,Bcl-2)、哺乳動物真核細胞胞質內調控蛋白(P62)、微管相關蛋白1輕鏈3(Microtubule-associated protein 1 light chain3,LC3)表達水平的影響。并且通過加入自噬特異性抑制劑(CQ)和激活劑(RAP),探究了自噬與凋亡的關系。結果顯示:1.不同質量濃度DON作用PC12細胞24 h后,對照組細胞飽滿,鏈接致密;處理組細胞之間空隙逐漸變大,喪失正常細胞的伸展形態(tài),體積縮小漸為圓形,視野內漂浮和貼壁不緊的細胞增多。透射電鏡觀察到對照組細胞胞質均勻;DON處理組細胞質中有空泡,產生了雙層或數(shù)層膜包裹的自噬小體和晚期自噬溶酶體結構,AO和MDC染色發(fā)現(xiàn),對照組細胞胞漿和核仁顯示綠色熒光,幾乎無紅色熒光,但DON刺激的細胞胞漿中的熒光點呈紅色。常規(guī)狀態(tài)下細胞MDC熒光強度較弱,伴隨DON濃度的上升MDC熒光信號愈發(fā)明顯,并有熒光積聚斑點。GFP-LC3轉染發(fā)現(xiàn),對照組GFP-LC3彌散分布于細胞中;自噬被誘導時,GFP-LC3大部分處于點狀分布。2.各處理組細胞的凋亡率均隨著DON濃度的增大而增大,極顯著高于對照組(P0.01),在1000 ng/mL時達到峰值。在DON濃度達到2000 ng/mL時,壞死率增高。3.采用激光共聚焦顯微鏡觀察LC3的聚點情況,對照組細胞呈微弱紅色熒光,且LC3未成點狀聚集;不同質量濃度的DON均可引起LC3發(fā)生聚點現(xiàn)象,在DON為1 000 ng/mL時發(fā)生LC3聚集的細胞數(shù)量最多。4.處理組細胞classⅢPI3K mRNA表達水平均極顯著高于(P0.01)對照組,且在125~1 000 ng/mL,classⅢPI3K mRNA表達水平逐漸增高,于1 000ng/mL濃度時達到峰值,之后表達水平下降。Beclin-1 mRNA表達水平經DON刺激后極顯著上升(P0.01),于1 000 ng/mL DON濃度組處于最大值。Bcl-2mRNA表達量隨著DON濃度的增加而減低,大于250 ng/mL時表現(xiàn)為極顯著降低(P0.01),于1000 ng/mL DON濃度時降至最低。LC3 mRNA表達水平隨著DON質量濃度的增加而顯著(P0.05)或極顯著(P0.01)提高,在DON濃度為1000 ng/mL時達到峰值。P62 mRNA相對表達量隨著DON質量濃度的升高而顯著(P0.05)或極顯著(P0.01)降低,在1 000 ng/mL DON時降至最低。另外,與1000 ng/mL DON相比,1000 ng/mL DON+PI3K抑制劑LY294002處理組classⅢPI3K、Beclin-1、LC3 mRNA表達水平均極顯著降低(P0.01),而Bcl-2、P62 mRNA表達水平明顯的升高。5.與對照組比較,classⅢPI3K蛋白表達水平在超過250 ng/mL時顯著(P0.05)或極顯著升高(P0.01),并隨著DON濃度的增加而升高,在1000 ng/mL時達到最大值;Beclin-1蛋白表達水平極顯著升高(P0.01),同樣也在1000ng/mL時達到峰值。LC3蛋白表達量在超過250 ng/mL時顯著(P0.05)或極顯著增加(P0.01),在1000 ng/mL時達到最大值;Bcl-2、P62蛋白表達量均極顯著的減少(P0.01),在1000 ng/mL時降到最低。另外,與1000 ng/mL DON處理組相比,1000 ng/mL DON+LY294002處理組classⅢPI3K、Beclin-1、LC3蛋白表達水平均極顯著降低(P0.01),而Bcl-2、P62蛋白表達水平明顯升高。6.與1000 ng/mL DON處理組相比,1000 ng/mL DON+CQ的LC3Ⅱ蛋白表達水平極顯著升高(P0.01)。125 ng/mL DON處理組與125 ng/mL DON+RAP處理組相比,125 ng/mL+RAP LC3Ⅱ蛋白表達量極顯著上升(P0.01)。7.與對照組相比,各處理組細胞凋亡率均顯著(P0.05)或極顯著升高(P0.01)。125 ng/mL DON+RAP處理組與125 ng/mL DON處理組相比,凋亡率極顯著下降(P0.01),1000 ng/mL DON+CQ處理組與1000 ng/mL DON處理組相比,凋亡率極顯著上升(P0.01)。綜上所述:DON能夠誘導PC12細胞產生凋亡和自噬,自噬相關基因和蛋白classⅢPI3K、Beclin-1、Bcl-2、P62、LC3參與了DON誘導PC12細胞自噬的調控。CQ抑制了DON誘導PC12細胞產生自噬的進程,RAP能夠使自噬表達水平上調。使用流式細胞儀測定凋亡率來反映其中的聯(lián)系,結果表明自噬的減弱會促使PC12細胞的凋亡率增加。
【圖文】：

2 結果與分析2.1 DON 對 PC12 細胞形態(tài)的影響分別用配制好的不同質量濃度的 DON 處理 PC12 細胞 24 h 后，倒置顯微鏡下觀察細胞的生長情況，結果表明，對照組（0 ng/mL DON）PC12 細胞飽滿，細胞充滿整個視野，緊密的鏈接在一起，甚至出現(xiàn)接觸抑制現(xiàn)象（圖 2-1-A）；DON 處理組隨著 DON 質量濃度的升高，PC12 細胞之間空隙逐漸變大，，凸起結構逐漸變少，喪失正常細胞的飽滿伸展形態(tài)，體積縮小漸為圓形，視野內漂浮和貼壁不緊的細胞增多（圖 1-B, C, D, E, F）。

26圖 2-2 DON 對 PC12 細胞凋亡的影響Fig2-2 Effect of DON on apoptosis in PC12 cells注：A. 細胞凋亡圖；B. DON 對 PC12 細胞凋亡的影響。**P < 0.01 表示與對照組相比差異極顯著。Note: A. Apoptosis picture; B. Effects of DON on apoptosis in PC12 cells. **P < 0.01 shows significantdifferences compared with the control group.2.3 AO 染色觀察 DON 對酸性自噬泡的影響自噬的形態(tài)特征是自噬體的累積，也叫做自噬泡。對照組細胞經 AO 染色后胞漿和核仁顯示綠色熒光，幾乎無紅色熒光，但 DON 處理中細胞胞漿中的熒光點呈紅色。終濃度為 0、125、250、500、1000、2000 ng/mL 的 DON 處理 PC12
【學位授予單位】：安徽農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S859.8

【參考文獻】

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本文編號：2641630