發(fā)布時間：2020-04-26 00:35

【摘要】：土拉弗朗西斯菌是一種細胞內(nèi)寄生的革蘭氏陰性短桿菌,可以通過呼吸道、消化道、傷口和昆蟲叮咬等多種途徑感染人類和多種動物引起土拉熱。由于土拉弗朗西斯菌對人具有很強的致病性,近年來,國內(nèi)外學(xué)者針對細菌的致病機制開展了大量的研究工作。我們前期毒力因子篩選研究發(fā)現(xiàn)土拉弗朗西斯菌greA基因突變株在感染小鼠體內(nèi)的存活能力顯著下降,預(yù)示該基因的表達及其產(chǎn)物影響了細菌感染和致病作用。已有的研究表明,細菌greA基因編碼轉(zhuǎn)錄延長因子GreA,其誘導(dǎo)的RNA聚合酶(RNAP)核酸切割活性在RNA延伸過程中可以降解停頓在復(fù)制通道中的RNA末端使其處于活性中心正確位置,進而抑制轉(zhuǎn)錄延長復(fù)合物轉(zhuǎn)錄暫停、促進RNAP從啟動子逃逸及增強基因轉(zhuǎn)錄保真性等。為探討GreA蛋白對土拉弗朗西斯菌感染及致病力的影響,本研究以土拉弗朗西斯菌新殺手亞種U112為模式菌株,利用同源重組構(gòu)建了 greA基因缺失株及反式回補株,體外培養(yǎng)檢測表明:1)greA基因缺失對土拉弗朗西斯菌的菌體形態(tài)、溫度敏感性和pH敏感性無顯著影響,但greA缺失細菌繁殖的代次時間延長、對高濃度NaCl的抵抗力下降,然而,細菌的生物膜形成能力顯著增強,表明GreA影響土拉弗朗西斯菌的環(huán)境適應(yīng)性;2)細胞感染實驗表明,土拉弗朗西斯菌greA基因缺失突變株對細胞的入侵及胞內(nèi)增殖顯著降低。小鼠感染實驗發(fā)現(xiàn),土拉弗朗西斯菌greA缺失株經(jīng)皮下或呼吸道感染小鼠的致病力顯著下降,缺失突變株在小鼠的肝臟、脾臟和肺臟中繁殖能力亦顯著低于親代,并且被快速清除,進一步證明GreA影響土拉弗朗西斯菌的致病力。為進一步探討GreA影響土拉弗朗西斯菌生理功能與致病力的分子機制,本研究利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)(RNA-seq)技術(shù)比較分析了 greA基因缺失突變株和親代毒株基因轉(zhuǎn)錄和表達的差異。RNA-Seq分析結(jié)果表明,greA基因缺失對土拉弗朗西斯菌新殺手亞種的196個基因表達產(chǎn)生顯著的影響(相差2倍以上),這些基因除了影響細菌氨基酸、碳水化合物及無機離子代謝外,其中77個差異表達基因與土拉弗朗西斯菌的致病力相關(guān),包括所有毒力島基因。利用β-半乳糖苷酶實驗證實pdpD、pepO、FTN_1104的啟動子活性可以被GreA調(diào)節(jié),表明GreA可以通過啟動子調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄。為驗證GreA對毒力基因表達調(diào)控的影響,本研究構(gòu)建了 FTN_1104、ampD和pepO等與細胞入侵相關(guān)的下調(diào)基因的缺失突變株,并通過細胞感染實驗證明FTN_1104和ampD缺失影響土拉弗朗西斯菌的細胞入侵。綜上,土拉弗朗西斯菌GreA蛋白可以通過調(diào)控基因啟動子等途徑影響細菌基因轉(zhuǎn)錄,進而調(diào)節(jié)細菌的環(huán)境適應(yīng)性、細菌對細胞的侵染和對宿主動物的致病力。細菌GreA蛋白的保守性及其對細菌致病力的影響,也為進一步開展土拉弗朗西斯菌的預(yù)防治療提供了一種新的藥物靶標。
【圖文】：

莢膜位于細菌的最外層，根據(jù)菌株的不同，主要由多糖或多肽組成。在土拉弗朗西斯菌中，逡逑土拉亞種與全北極亞種菌體外層均含有莢膜樣物質(zhì)，它們的主要成分為脂質(zhì)、糖蛋白與多糖復(fù)合逡逑物［２８１（圖１－２）。先前的研究一般認為新殺手亞種不形成莢膜，但最新研究顯示，新殺手亞種菌株逡逑在適當條件下培養(yǎng)后，可以形成類似于土拉亞種的莢膜樣物質(zhì)，并且這些莢膜樣物質(zhì)的糖基化有逡逑助于細菌的致病力與免疫保護｜２７］。莢膜缺失菌株對血清補體更加敏感，對小鼠的致病力也隨之下逡逑降［？３２］。蘇敬良等發(fā)現(xiàn)土拉弗朗西斯菌中含有炭疽桿菌聚Ｙ谷氨酸莢膜生物合成的同源基因操縱逡逑子，并將其命名為缺失這些基因后可以導(dǎo)致細菌的細胞內(nèi)適應(yīng)性下降、對小鼠的致病逡逑力下降［３３］。但相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，ＣａｐＡＢＣ并不參與莢膜的合成［３２１。土拉亞種與全北極亞種莢膜多糖逡逑與ＬＰＳ的Ｏ抗原結(jié)構(gòu)基本相同，因此可以將其歸類為Ｏ抗原莢膜［氣進一步研究發(fā)現(xiàn)，破壞ＬＰＳ逡逑的０抗原生物合成有關(guān)的部分糖基轉(zhuǎn)移酶基因（ｗ汾／，邐ｗ＆Ｍ邋ｗ＆Ｃ）會導(dǎo)致莢膜的逡逑丟失１３２），表明土拉弗朗西斯菌的０抗原莢膜與其ＬＰＳ的０抗原生物合成及組

４－２０邋ｈｒｓ邐Ｚ逡逑ｐｏｓｔ－ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ逡逑圖１－１邋土拉弗朗西斯菌對巨噬細胞的感染逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－１邋Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋Ｆ．邋ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ邋ｉｎ邋ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ１＇８１逡逑通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，土拉弗朗西斯菌中不存在其它胞內(nèi)寄生菌中普遍存在的毒素基因逡逑與分泌系統(tǒng)，同時，它也缺乏其它胞內(nèi)寄生菌吞噬泡逃逸的同源基因。因此，土拉弗朗西斯菌中逡逑必然存在獨有的細胞入侵及吞噬泡逃逸機制，輔助其完成細胞感染。目前已知的與土拉弗朗西斯逡逑菌細胞感染相關(guān)的毒力因子主要包括莢膜、脂多糖（ＬＰＳ）、ＶＩ型菌毛系統(tǒng)、幾種分泌系統(tǒng)、夕卜逡逑膜蛋白、毒力島以及部分代謝基因等ｐ７］。逡逑１．３．１莢膜逡逑莢膜位于細菌的最外層，根據(jù)菌株的不同，主要由多糖或多肽組成。在土拉弗朗西斯菌中，逡逑土拉亞種與全北極亞種菌體外層均含有莢膜樣物質(zhì)，它們的主要成分為脂質(zhì)、糖蛋白與多糖復(fù)合逡逑物［２８１（圖１－２）。先前的研究一般認為新殺手亞種不形成莢膜，，但最新研究顯示，新殺手亞種菌株逡逑在適當條件下培養(yǎng)后，可以形成類似于土拉亞種的莢膜樣物質(zhì)，并且這些莢膜樣物質(zhì)的糖基化有逡逑助于細菌的致病力與免疫保護｜２７］。莢膜缺失菌株對血清補體更加敏感
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S852.61

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本文編號：2640877