【摘要】：研究表明,內(nèi)分泌變化可能是氨基酸(AA)供給影響奶牛乳蛋白合成的途徑之一。胰島素,作為體內(nèi)唯一降低血糖濃度的激素,對(duì)乳蛋白合成有重要的調(diào)控作用。然而在泌乳動(dòng)物上影響胰島素分泌的AA種類和其作用途徑還缺乏系統(tǒng)的認(rèn)識(shí),因此本研究以泌乳大鼠、泌乳小鼠、泌乳山羊和β細(xì)胞系為模型,比較不同必需氨基酸(essential amino acid,EAA)對(duì)胰島素分泌的影響及其作用途徑,以期為泌乳動(dòng)物氨基酸需要評(píng)定策略提供一定理論參考。1.日糧蛋白水平對(duì)泌乳大鼠胰島素濃度的影響。泌乳大鼠分娩后隨機(jī)飼喂9%、21%和35%三種蛋白水平的日糧15天,以觀察其對(duì)血漿和胰腺內(nèi)胰島素和胰高血糖素濃度的影響。結(jié)果表明,與9%和21%蛋白日糧相比,35%蛋白日糧分別提高了血漿胰島素(25%和37%)和胰高血糖素(17%和31%)的濃度;但這兩種激素在胰腺內(nèi)的含量卻以21%蛋白日糧組最高。35%蛋白日糧飼喂下,泌乳大鼠肝臟糖異生的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase,PEPCK)和葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6-phosphatase,G6Pase)的活性顯著高于另外兩個(gè)處理組。將三個(gè)處理組的數(shù)據(jù)合并后分析發(fā)現(xiàn),血漿一氧化氮(nitric oxide,NO)濃度與循環(huán)血液中胰島素的水平顯著負(fù)相關(guān),但與胰腺內(nèi)胰島素、胰高血糖素和二者的比值(insulin-to-glucagon ratio,IGR)顯著正相關(guān)。多元回歸分析發(fā)現(xiàn),血漿胰島素水平主要與血漿中蘇氨酸(Thr)和苯丙氨酸(Phe)濃度相關(guān),而胰高血糖素水平則主要與纈氨酸(Val)、絲氨酸(Ser)、天冬酰胺(Asn)和瓜氨酸(Cit)相關(guān)。2.梯度EAA供給對(duì)大鼠β細(xì)胞胰島素分泌和線粒體代謝的影響。培養(yǎng)基中0%、20%、40%、60%和100%含量(對(duì)照組)的EAA處理INS-1細(xì)胞24 h以觀察其對(duì)長期胰島素分泌和線粒體代謝的影響。培養(yǎng)基中EAA含量的增加以二次方的形式降低了INS-1細(xì)胞胰島素的分泌和細(xì)胞內(nèi)胰島素的含量以及AA轉(zhuǎn)運(yùn)載體的基因表達(dá),但對(duì)胰島素基因(Ins2)表達(dá)沒有影響。另一方面,梯度EAA增加雖然對(duì)INS-1細(xì)胞葡萄糖攝入和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因表達(dá)沒有影響,但以二次方的形式改變了細(xì)胞內(nèi)腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphoric acid,ATP)的濃度并線性降低了線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(transcription factor A,Tfam)、解偶聯(lián)蛋白2(uncoupling protein2,Ucp2)和線粒體關(guān)鍵酶的基因表達(dá)。3.單一EAA刺激對(duì)大鼠β細(xì)胞胰島素分泌和線粒體代謝的影響。含有11.1 mM葡萄糖和10 mM濃度單一EAA的Krebs-Ringer bicarbonate HEPES buffer(KRBH)溶液處理INS-1細(xì)胞1 h來觀察單一EAA短期處理對(duì)胰島素分泌和線粒體代謝的影響。結(jié)果表明:與不添加EAA的對(duì)照組(None)相比,高濃度的精氨酸(Arg)短期處理促進(jìn)了INS-1細(xì)胞胰島素的分泌,而色氨酸(Trp)則抑制胰島素的分泌;并且該兩種EAA處理均顯著降低了INS-1細(xì)胞內(nèi)ATP的含量。熒光定量分析發(fā)現(xiàn),與None處理相比,高濃度組氨酸(His)、亮氨酸(Leu)和Thr處理降低了Tfam基因的表達(dá),10 mM的His、異亮氨酸(Ile)、Thr和纈氨酸(Val)處理提高了Pdx1基因的表達(dá)。對(duì)照組基礎(chǔ)上添加高濃度的Ile和Phe提高了線粒體NADPH脫氫酶4L亞基(NADH dehydrogenase subunit 4L,Nd4l)基因的豐度,但添加高濃度的Arg和His降低了酮戊二酸脫氫酶(oxoglutarate dehydrogenase,Ogdh)基因的表達(dá)。另外,Arg處理相比對(duì)照組增加了INS-1細(xì)胞的Ca~(2+)濃度。4.日糧添加和缺失Arg對(duì)泌乳小鼠胰島素濃度的影響。泌乳小鼠分娩后分別飼喂不同試驗(yàn)日糧15天來觀察補(bǔ)充或缺失Arg對(duì)胰島素分泌、肝臟糖異生和Arg代謝的影響。試驗(yàn)處理為:9%蛋白水平日糧(LP)、9%蛋白+Arg日糧(LP+Arg)、21%蛋白水平日糧(HP)和21%蛋白-Arg日糧(HP-Arg),缺失或增加的Arg量等于12%蛋白日糧中含有的Arg數(shù)量。結(jié)果表明,與9%蛋白日糧相比,21%蛋白日糧顯著增加了母鼠體增重和仔鼠窩增重以及血漿中葡萄糖、NO和Arg濃度。21%蛋白日糧缺失Arg促進(jìn)了乳腺β-酪蛋白(casein beta,Csn2)的表達(dá),但降低了血漿Arg的濃度。9%蛋白日糧添加Arg顯著增加了血漿中胰島素的濃度和IGR,但降低了胰腺中胰高血糖素的含量。與21%蛋白日糧相比,缺失Arg同樣增加了循環(huán)血液中胰島素濃度和IGR,但降低了胰腺內(nèi)胰島素和胰高血糖素的含量。添加和缺失Arg均顯著降低了肝臟PEPCK、G6Pase和精氨酸酶(Arginase)的活性。同時(shí),低蛋白日糧添加Arg降低了蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(protein arginine methyltransferase,RPMT)的活性而高蛋白日糧缺失Arg則增加了肝臟一氧化氮合成酶(nitric oxide synthetase,NOS)的活性。5.不同Arg供給對(duì)小鼠β細(xì)胞胰島素分泌和線粒體代謝的影響。含0、0.04、0.4、4(對(duì)照組)和8 mM濃度Arg的培養(yǎng)基處理MIN6細(xì)胞24 h以觀察不同Arg供給對(duì)胰島素分泌與線粒體代謝的影響。結(jié)果表明,標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中減少或增加Arg均降低了MIN6細(xì)胞的活力但增加了細(xì)胞內(nèi)NOS的基因表達(dá)和蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)的活性。與0.4 mM處理相比,0.04處理增加了MIN6細(xì)胞胰島素的分泌而4和8處理組降低了胰島素的分泌。此外,與對(duì)照組相比,0和0.04 mM濃度Arg增加了細(xì)胞內(nèi)胰島素的含量和葡萄糖激酶(glucokinase,GCK)的活性,但降低了MIN6細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取。6.頸靜脈灌注不同AA對(duì)泌乳山羊胰島素濃度的影響。5頭泌乳奶山羊禁飼24小時(shí)后頸靜脈灌注AA混合物8小時(shí)以觀察Ile、Leu、蛋氨酸(Met)及Thr(ILMT)和其他AA(RAA)對(duì)胰島素分泌和生產(chǎn)性能的影響。試驗(yàn)處理為灌注液中:(1)不含所有AA(NTAA);(2)含3倍代謝蛋白(metabolic protein requirement,MP)需要量的ILMT,但不含RAA(3F0R);(3)3F0R基礎(chǔ)上添加1倍、2倍和3倍MP需要量的RAA(3F1R,3F2R和3F3R)。結(jié)果表明,相比NTAA組,添加ILMT的其他處理組趨于增加乳蛋白產(chǎn)量和血漿葡萄糖濃度,并顯著增加產(chǎn)奶量和乳糖產(chǎn)量,但對(duì)乳脂產(chǎn)量和含量沒有影響。梯度補(bǔ)充RAA趨于以二次方的形式影響產(chǎn)奶量和乳糖產(chǎn)量。隨著灌注液中RAA的增加,動(dòng)脈血糖和胰高血糖素濃度以線性方式、胰島素濃度以二次方的形式降低。添加ILMT顯著降低了乳腺P70 S6激酶(P70 S6 kinase,P70S6K)蛋白的磷酸化水平,但后者隨RAA梯度補(bǔ)充而線性增加。以上結(jié)果表明:(1)血漿AA和NO濃度以及肝臟糖異生可能參與日糧蛋白水平對(duì)泌乳大鼠血漿和胰腺胰島素和胰高血糖素濃度的影響。(2)培養(yǎng)基中梯度缺失EAA增加了胰島素的分泌和細(xì)胞內(nèi)胰島素的含量,并且這種變化伴隨線粒體內(nèi)代謝酶和胰島素分泌調(diào)控因子基因表達(dá)的提高(3)高濃度的Arg處理1 h引起INS-1細(xì)胞內(nèi)Ca~(2+)濃度的增加并促進(jìn)了胰島素的短期分泌,Trp對(duì)胰島素分泌則呈現(xiàn)抑制作用,而其他AA則對(duì)胰島素分泌沒有影響。(4)日糧和培養(yǎng)基中缺失和添加Arg引起的AA不平衡改變了胰島素的分泌和β細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝入。(5)ILMT和其他AA對(duì)泌乳山羊胰島素的分泌影響不同,并且其作用效果可能與血漿濃度存在一定關(guān)系。
【圖文】：

3圖 1.1 胰島β細(xì)胞胰島素分泌的兩相過程（Newsholme et al. , 2014）。e 1.1 The pancreatic β cell biphasic insulin secretion response（Newsholme et al. ,

程（Bratanova-Tochkova et al. , 2002），例如磷脂酶 C（p酶 C（protein kinase C, PKC）或腺苷酸環(huán)化酶（adenylateprotein kinase A, PKA）途徑，如圖 1.2 所示。下面對(duì)這兩
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S816

【參考文獻(xiàn)】

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1 王皓宇;秦彤;郝海生;杜衛(wèi)華;趙學(xué)明;朱化彬;;胰島素對(duì)體外培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞乳蛋白、乳脂肪合成相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響[J];畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào);2013年05期

2 文靜;卜登攀;王建發(fā);孫鵬;;激素調(diào)控乳蛋白合成的作用及其分子機(jī)制[J];華北農(nóng)學(xué)報(bào);2012年S1期

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本文編號(hào)：2640864