【摘要】：法氏囊是各種病原微生物的靶器官,一些免疫性疾病常使其受損甚至發(fā)生萎縮,從而引起免疫抑制,因此對(duì)免疫器官的研究是為了更好地了解其免疫狀態(tài)和機(jī)制,為我們的育種工作提供更好的條件。本實(shí)驗(yàn)以舊院黑雞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)探索蛋雞法氏囊的發(fā)育分子機(jī)制,從中篩選出了影響法氏囊生長(zhǎng)和萎縮的主要差異基因,并對(duì)差異基因進(jìn)行了驗(yàn)證;以期闡述差異基因在法氏囊發(fā)育及萎縮的整個(gè)過(guò)程中的調(diào)控作用,獲得的主要結(jié)果如下:(1)通過(guò)組織學(xué)實(shí)驗(yàn)分別得到7、42、90、120日齡的法氏囊組織切片,在顯微鏡下觀察顯示在7日齡和42日齡時(shí)的法氏囊皮髓部界限清晰,細(xì)胞排列緊密并充滿(mǎn)淋巴細(xì)胞,90日齡、120日齡觀察到法氏囊淋巴細(xì)胞開(kāi)始稀疏并消失,髓質(zhì)部的網(wǎng)狀細(xì)胞逐漸退化,呈現(xiàn)細(xì)胞纖維化。表明法氏囊的生長(zhǎng)呈現(xiàn)隨日齡增長(zhǎng)在不斷成熟后逐漸萎縮最后消失的過(guò)程;(2)通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,12個(gè)法氏囊組織樣本平均每個(gè)文庫(kù)獲得高質(zhì)量測(cè)序數(shù)據(jù)Q3090%,法氏囊7日齡、42日齡、90日齡和120日齡分別得到20,386,250、20,953,999、20,306,163和20,581,551個(gè)reads;測(cè)序結(jié)果的reads數(shù)與家雞祖先紅色原雞基因組(galGal4)序列進(jìn)行比對(duì)uniquely mapping也均大于90%;說(shuō)明本研究測(cè)序所得數(shù)據(jù)質(zhì)量較高,能充分滿(mǎn)足后期的分析要求;(3)根據(jù)表達(dá)量發(fā)現(xiàn),7日齡與42日齡比較,發(fā)現(xiàn)5628個(gè)差異基因(Fold change1,P0.05),上調(diào)差異基因3549個(gè),下調(diào)基因2079個(gè);42日齡與90日齡比較,發(fā)現(xiàn)593個(gè)差異基因(Fold change1,P0.05),其中上調(diào)基因有291個(gè),下調(diào)基因有312個(gè);90日齡與120日齡比較,共發(fā)現(xiàn)327個(gè)差異基因(Fold change1,P0.05),其中上調(diào)基因131個(gè),下調(diào)基因196個(gè);(4)根據(jù)GO功能分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),從7-120日齡,分別主要聚集在胞外區(qū)、細(xì)胞核、并與免疫應(yīng)答、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡相關(guān),主要是一些炎癥因子和凋亡因子。根據(jù)KEGG信號(hào)通路分析,主要富集在細(xì)胞黏連、細(xì)胞吞噬、細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路中,通過(guò)對(duì)GO和KEGG的綜合分析,篩選出9個(gè)差異表達(dá)基因(SPP1、BICR2、CTNNB1、BMF、SELE、TUBB3、TUBA8、TUBA3E和LMNB2),提示這些基因可能是調(diào)控法氏囊生長(zhǎng)及萎縮的主要基因;(5)利用qRT-PCR驗(yàn)證了9個(gè)差異表達(dá)基因在法氏囊生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)情況,實(shí)驗(yàn)結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組的結(jié)果基因一致,說(shuō)明研究結(jié)果可以反映法氏囊在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)情況;(6)通過(guò)免疫熒光實(shí)驗(yàn)對(duì)篩選的部分差異基因進(jìn)行蛋白水平驗(yàn)證,對(duì)篩選的TUBB3和LMNB2兩個(gè)基因進(jìn)行了免疫熒光實(shí)驗(yàn),結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組的結(jié)果基因一致,說(shuō)明TUBB3和LMNB2基因可以翻譯成蛋白;綜上,法氏囊的生長(zhǎng)呈現(xiàn)隨日齡增長(zhǎng)在不斷成熟后逐漸萎縮最后消失的過(guò)程,并從轉(zhuǎn)錄組層面篩選了雞法氏囊的基因表達(dá)差異(SPP1、BIRC2、CTNNB1、BMF、SELE、TUBB3、TUBA8、TUBA3E、LMNB2基因),這幾個(gè)基因反應(yīng)了法氏囊在不同時(shí)間斷生長(zhǎng)發(fā)育的特性。為了研究法氏囊生長(zhǎng)發(fā)育奠定了基礎(chǔ),同時(shí)也為以后更好的研究法氏囊的功能奠定了基礎(chǔ),從而為我們的育種工作提供更好的條件。
【圖文】：

圖 1.1 比較人類(lèi)和禽類(lèi)免疫球蛋白(Ig)基因的多樣化Fig 1.1 Comparison of human and avian immunoglobulin（Ig）gene diversification1.1.5 與法氏囊發(fā)育相關(guān)的因子影響法氏囊發(fā)育及功能的主要基因 Bcl-2 基因家族是調(diào)控細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵能夠抑制細(xì)胞凋亡，延長(zhǎng)細(xì)胞壽命[21]。ERα基因被認(rèn)為是免疫功能的調(diào)節(jié)器，用是增強(qiáng)或減弱機(jī)體的免疫能力；例如在雞胚胎時(shí)期，雌性激素可以調(diào)節(jié)雞孵體抗體的生成，因此認(rèn)為雌激素能作用于法氏囊，調(diào)節(jié)法氏囊的生長(zhǎng)發(fā)育并淋巴細(xì)胞的分化和增殖[22]。在法氏囊中發(fā)現(xiàn)的白細(xì)胞介素（interleukin,IL）主要有IL-6，IL-10，IL-12[23]，他們可能參與調(diào)節(jié)法氏囊免疫細(xì)胞的生長(zhǎng)和功能。法自身還存在著一些免疫活性因子，主要是法氏囊組織液中的活性肽和細(xì)胞因子法氏囊活性肽：三肽囊素（Bursin）可以促進(jìn)法氏囊中濾泡 B 淋巴細(xì)胞的發(fā)育和進(jìn)而提高抗體水平，增強(qiáng)禽類(lèi)的免疫力[24]；有研究表明：法氏囊抗類(lèi)固醇

圖 3-1 不同日齡法氏囊組織學(xué)結(jié)構(gòu)（HE 染色）；左上為 7 日齡，右上為日齡，左下為 90 日齡，右下為 120 日齡Fig 3-1 The histological structure of bursa of fabricius at different stages ( HEstaining ) 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果.1 RNA 質(zhì)量檢測(cè)抽提的總 RNA 在冰上融化，混勻后 4℃離心，在濃度與完整性檢測(cè)前將 RN一定比例進(jìn)行稀釋。利用 NanoDrop 2000 微量分光光度計(jì)檢測(cè)，樣品的260/280 比值均在 1.8-2.0 之間，，沒(méi)有被苯酚、蛋白和其他雜質(zhì)污染，并通過(guò) Ag0 Bioanalyzer，Agilent RNA6000 Nano kit 檢測(cè)方法對(duì)樣本濃度進(jìn)行精確定量
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：S831.2

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本文編號(hào)：2641018