【摘要】：精原干細胞(SSCs)是一種位于雄性動物曲細精管基底膜上的成體干細胞,作為一種具有自我更新能力及分化潛能的一種生殖細胞,是精子發(fā)生起始過程中的重要組成部分。目前SSCs的體外培養(yǎng)和移植對于研究雄性生殖功能的恢復、轉基因動物生產以及雄性生殖細胞分化機理研究有著重要的意義。雖然目前SSCs小鼠的體外培養(yǎng)體系已經較為成熟,參與SSCs自我更新調控的許多分子的功能已被確定,然而仍然有許多能夠影響SSCs的細胞因子尚未被發(fā)現。因此,進一步研究可能影響SSCs增殖、分化的細胞因子,發(fā)現其對體外培養(yǎng)SSCs的具體影響,能夠探索完善相關細胞因子的功能,發(fā)現新的SSCs調控因子,同時能夠為其他哺乳動物SSCs的長期體外培養(yǎng)體系提供借鑒。上皮調節(jié)蛋白(Epiregulin)是表皮生長因子家族的成員之一,能夠通過表皮生長因子受體(EGFR)的配體調控正常細胞增殖以及抑制腫瘤上皮細胞的增殖。上皮有絲分裂原(Epigen)存在于睪丸、心臟和肝臟中,作為ErbB受體的配體能夠促進細胞的有絲分裂。干細胞因子(SCF)其作為一種多功能細胞因子,能夠結合其配體C-Kit通過激活相關信號調節(jié)多種細胞的生存、增殖以及分化。SCF廣泛存在于祖細胞、造血干細胞以及生殖細胞等組織中,研究表明SCF在生殖干細胞的生長調控過程中具有十分重要的生理功能。本研究通過探究在含有GDNF、bFGF、LIF的SSCs培養(yǎng)基中添加Epiregulin、Epigen和SCF對山羊精原干細胞增殖的影響,研究Epiregulin、Epigen和SCF在體外培養(yǎng)過程中對山羊SSCs增殖、細胞池維持以及分化的關鍵基因以及其增殖通路的關鍵蛋白的影響,為其他SSCs培養(yǎng)以及研究提供相關的理論參考。本研究獲得的主要結果如下:1.通過兩步酶消化法和差速貼壁對其SSCs進行提取和富集。富集后的精原干細胞其SSCs相關標記基因顯著高于貼壁的支持細胞,對富集后SSCs進行熒光染色鑒定,結果顯示純化后的SSCs其CD9和GFRa1呈陽性。2.在基礎培養(yǎng)基中添加20 ng/mL Epiregulin、100 ng/mL Epigen和20 ng/mL SCF可以顯著促進山羊精原干細胞的增殖(P0.05),其中添加20 ng/mL Epiregulin和100 ng/mL Epigen的效果顯著高于其他組(P0.05),但兩組間無顯著差異(P0.05)。添加20 ng/ml SCF培養(yǎng)基顯著低于上述兩組(P0.05)但顯著高于對照組(P0.05)。添加Epiregulin、Epigen和SCF均能夠提高SSCs的細胞活力,其中添加20 ng/mL Epiregulin具有最佳的提高效果(P0.05),其細胞活力達到1.4±0.08。3.在基礎培養(yǎng)基中添加100 ng/mL Epigen和20 ng/mL Epiregulin能夠顯著上調SSCs增殖關鍵基因LHX 1、C-RET、ETV5和GFRA1的表達(P0.05)而添加20 ng/ml SCF和Epigen與對照組差異不顯著(P0.05)。而添加20 ng/mL Epiregulin和SCF能夠上調SSCs分化相關基因STRA8和C-KIT,其中添加20 ng/mL SCF的效果顯著高于20 ng/mL Epiregulin(P0.05)。同時各組之間的OCT4和PLZF的表達并無顯著差異(P0.05)。培養(yǎng)基中添加100 ng/mL Epigen、20 ng/mL Epiregulin和20 ng/mL SCF能夠提高SSCs的AKT和p-AKT蛋白表達。在基礎培養(yǎng)基中添加Epiregulin、Epigen以及SCF能夠促進SSCs的增殖,其中添加100 ng/mL Epigen和20 ng/mL的Epiregulin能夠顯著促進SSCs的增殖,顯著上調SSCs部分增殖關鍵基因和AKT蛋白的表達。
【圖文】：

后的研究表明，利用不同的處理和培養(yǎng)條件成功地將幼年小鼠和成年小鼠的 SS為 ES-LC，而進一步證實 SSCs 可以在某些培養(yǎng)條件下轉化為多能細胞（Guan et a；Seandel et al. 2007；Izadyar et al. 2008），然而由于當時對于 SSCs 不同群的純化和尚不透徹，導致其轉換成多能細胞的確切機制的研究并不完善，其很可能涉及的表ct4、sox2、c-Myc 以及 KLF4 等核心轉錄因子對 IPSS 的誘導（Takahashi et al. 2003）。

Src 家族激酶從而介導 PI3 激酶/Akt 途徑而起到調節(jié)作用。.5.1.2 成纖維細胞生長因子 2(FGF2/bFGF)FGF2 是 SSCs 細胞培養(yǎng)中另一不可或缺的外在因子。GDNF 和 FGF2 均能夠激活AP2K1，但 FGF2 具有更強的結合能力（Kanatsu-Shinoharaetal 2013；Mei et al. 2015）。時研究發(fā)現 MAP2K1 的磷酸化可替代 FGF2 的添加，從而證實 FGF2 通過 MAP2K徑促進增殖。其中三種轉錄因子（Bcl6b、Etv5 和 Lhx1）在 FGF2 途徑的下游起作用，為它們在 MAP2K1 失活后下調（Takashima et al. 2015）。然而，在先前的研究中，這個轉錄因子能夠通過 SFK 信令作用 GDNF 的下游，這表明 GDNF 和 FGF2 信令可能部分冗余的（Mei et al. 2015）。另外，他們發(fā)現 FGF2 的下游 MEK（促分裂原活化蛋激酶/ ERK1 激酶），其激活是細胞周期進程的關鍵信號。在添加 MEK 抑制劑的情況，其能夠顯著抑制 GS 細胞增殖，而具有活化 MEK 的 GS 細胞僅用 GDNF 便能夠在外表達出高增殖能力，表明 FGF2 可能是通過 MEK 的激活上調起到與 GDNF 協(xié)同促 SSCs 自我更新的作用（Guo et al. 2017）�？傮w而言，，Kanatsu-Shinohara 等（2013）認 FGF2 可以通過通過復雜的多種信號途徑與 GDNF 協(xié)同促進 SSC 自我更新和增殖。
【學位授予單位】：西北農林科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S827

【參考文獻】

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1 于雪;水牛精原干細胞的體外培養(yǎng)與鑒定及轉基因干細胞的異種移植[D];華中農業(yè)大學;2014年

2 朱海鯨;CD49f和miR-302對奶山羊雄性生殖干細胞體外培養(yǎng)生物學特性的影響[D];西北農林科技大學;2014年

本文編號：2638946