【摘要】：精原干細(xì)胞(SSCs)是一種位于雄性動(dòng)物曲細(xì)精管基底膜上的成體干細(xì)胞,作為一種具有自我更新能力及分化潛能的一種生殖細(xì)胞,是精子發(fā)生起始過(guò)程中的重要組成部分。目前SSCs的體外培養(yǎng)和移植對(duì)于研究雄性生殖功能的恢復(fù)、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)以及雄性生殖細(xì)胞分化機(jī)理研究有著重要的意義。雖然目前SSCs小鼠的體外培養(yǎng)體系已經(jīng)較為成熟,參與SSCs自我更新調(diào)控的許多分子的功能已被確定,然而仍然有許多能夠影響SSCs的細(xì)胞因子尚未被發(fā)現(xiàn)。因此,進(jìn)一步研究可能影響SSCs增殖、分化的細(xì)胞因子,發(fā)現(xiàn)其對(duì)體外培養(yǎng)SSCs的具體影響,能夠探索完善相關(guān)細(xì)胞因子的功能,發(fā)現(xiàn)新的SSCs調(diào)控因子,同時(shí)能夠?yàn)槠渌溉閯?dòng)物SSCs的長(zhǎng)期體外培養(yǎng)體系提供借鑒。上皮調(diào)節(jié)蛋白(Epiregulin)是表皮生長(zhǎng)因子家族的成員之一,能夠通過(guò)表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)的配體調(diào)控正常細(xì)胞增殖以及抑制腫瘤上皮細(xì)胞的增殖。上皮有絲分裂原(Epigen)存在于睪丸、心臟和肝臟中,作為ErbB受體的配體能夠促進(jìn)細(xì)胞的有絲分裂。干細(xì)胞因子(SCF)其作為一種多功能細(xì)胞因子,能夠結(jié)合其配體C-Kit通過(guò)激活相關(guān)信號(hào)調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的生存、增殖以及分化。SCF廣泛存在于祖細(xì)胞、造血干細(xì)胞以及生殖細(xì)胞等組織中,研究表明SCF在生殖干細(xì)胞的生長(zhǎng)調(diào)控過(guò)程中具有十分重要的生理功能。本研究通過(guò)探究在含有GDNF、bFGF、LIF的SSCs培養(yǎng)基中添加Epiregulin、Epigen和SCF對(duì)山羊精原干細(xì)胞增殖的影響,研究Epiregulin、Epigen和SCF在體外培養(yǎng)過(guò)程中對(duì)山羊SSCs增殖、細(xì)胞池維持以及分化的關(guān)鍵基因以及其增殖通路的關(guān)鍵蛋白的影響,為其他SSCs培養(yǎng)以及研究提供相關(guān)的理論參考。本研究獲得的主要結(jié)果如下:1.通過(guò)兩步酶消化法和差速貼壁對(duì)其SSCs進(jìn)行提取和富集。富集后的精原干細(xì)胞其SSCs相關(guān)標(biāo)記基因顯著高于貼壁的支持細(xì)胞,對(duì)富集后SSCs進(jìn)行熒光染色鑒定,結(jié)果顯示純化后的SSCs其CD9和GFRa1呈陽(yáng)性。2.在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加20 ng/mL Epiregulin、100 ng/mL Epigen和20 ng/mL SCF可以顯著促進(jìn)山羊精原干細(xì)胞的增殖(P0.05),其中添加20 ng/mL Epiregulin和100 ng/mL Epigen的效果顯著高于其他組(P0.05),但兩組間無(wú)顯著差異(P0.05)。添加20 ng/ml SCF培養(yǎng)基顯著低于上述兩組(P0.05)但顯著高于對(duì)照組(P0.05)。添加Epiregulin、Epigen和SCF均能夠提高SSCs的細(xì)胞活力,其中添加20 ng/mL Epiregulin具有最佳的提高效果(P0.05),其細(xì)胞活力達(dá)到1.4±0.08。3.在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加100 ng/mL Epigen和20 ng/mL Epiregulin能夠顯著上調(diào)SSCs增殖關(guān)鍵基因LHX 1、C-RET、ETV5和GFRA1的表達(dá)(P0.05)而添加20 ng/ml SCF和Epigen與對(duì)照組差異不顯著(P0.05)。而添加20 ng/mL Epiregulin和SCF能夠上調(diào)SSCs分化相關(guān)基因STRA8和C-KIT,其中添加20 ng/mL SCF的效果顯著高于20 ng/mL Epiregulin(P0.05)。同時(shí)各組之間的OCT4和PLZF的表達(dá)并無(wú)顯著差異(P0.05)。培養(yǎng)基中添加100 ng/mL Epigen、20 ng/mL Epiregulin和20 ng/mL SCF能夠提高SSCs的AKT和p-AKT蛋白表達(dá)。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加Epiregulin、Epigen以及SCF能夠促進(jìn)SSCs的增殖,其中添加100 ng/mL Epigen和20 ng/mL的Epiregulin能夠顯著促進(jìn)SSCs的增殖,顯著上調(diào)SSCs部分增殖關(guān)鍵基因和AKT蛋白的表達(dá)。
【圖文】：

后的研究表明，利用不同的處理和培養(yǎng)條件成功地將幼年小鼠和成年小鼠的 SS為 ES-LC，而進(jìn)一步證實(shí) SSCs 可以在某些培養(yǎng)條件下轉(zhuǎn)化為多能細(xì)胞（Guan et a；Seandel et al. 2007；Izadyar et al. 2008），然而由于當(dāng)時(shí)對(duì)于 SSCs 不同群的純化和尚不透徹，導(dǎo)致其轉(zhuǎn)換成多能細(xì)胞的確切機(jī)制的研究并不完善，其很可能涉及的表ct4、sox2、c-Myc 以及 KLF4 等核心轉(zhuǎn)錄因子對(duì) IPSS 的誘導(dǎo)（Takahashi et al. 2003）。

Src 家族激酶從而介導(dǎo) PI3 激酶/Akt 途徑而起到調(diào)節(jié)作用。.5.1.2 成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子 2(FGF2/bFGF)FGF2 是 SSCs 細(xì)胞培養(yǎng)中另一不可或缺的外在因子。GDNF 和 FGF2 均能夠激活A(yù)P2K1，但 FGF2 具有更強(qiáng)的結(jié)合能力（Kanatsu-Shinoharaetal 2013；Mei et al. 2015）。時(shí)研究發(fā)現(xiàn) MAP2K1 的磷酸化可替代 FGF2 的添加，從而證實(shí) FGF2 通過(guò) MAP2K徑促進(jìn)增殖。其中三種轉(zhuǎn)錄因子（Bcl6b、Etv5 和 Lhx1）在 FGF2 途徑的下游起作用，為它們?cè)?MAP2K1 失活后下調(diào)（Takashima et al. 2015）。然而，在先前的研究中，這個(gè)轉(zhuǎn)錄因子能夠通過(guò) SFK 信令作用 GDNF 的下游，這表明 GDNF 和 FGF2 信令可能部分冗余的（Mei et al. 2015）。另外，他們發(fā)現(xiàn) FGF2 的下游 MEK（促分裂原活化蛋激酶/ ERK1 激酶），其激活是細(xì)胞周期進(jìn)程的關(guān)鍵信號(hào)。在添加 MEK 抑制劑的情況，其能夠顯著抑制 GS 細(xì)胞增殖，而具有活化 MEK 的 GS 細(xì)胞僅用 GDNF 便能夠在外表達(dá)出高增殖能力，表明 FGF2 可能是通過(guò) MEK 的激活上調(diào)起到與 GDNF 協(xié)同促 SSCs 自我更新的作用（Guo et al. 2017）。總體而言，，Kanatsu-Shinohara 等（2013）認(rèn) FGF2 可以通過(guò)通過(guò)復(fù)雜的多種信號(hào)途徑與 GDNF 協(xié)同促進(jìn) SSC 自我更新和增殖。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：S827

【參考文獻(xiàn)】

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1 于雪;水牛精原干細(xì)胞的體外培養(yǎng)與鑒定及轉(zhuǎn)基因干細(xì)胞的異種移植[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

2 朱海鯨;CD49f和miR-302對(duì)奶山羊雄性生殖干細(xì)胞體外培養(yǎng)生物學(xué)特性的影響[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2014年

本文編號(hào)：2638946