【摘要】：豬血凝性腦脊髓炎是由豬血凝性腦脊髓炎病毒(Porcine hmagglutinating encephalomyelitis virus,PHEV)引起的一種急性、傳染性疾病,其主要感染幼齡仔豬,成年豬多呈隱形感染。該病的主要臨床癥狀表現(xiàn)為嘔吐、腹瀉和神經(jīng)等癥狀。感染該病毒的仔豬通常會出現(xiàn)兩種癥狀:嘔吐消耗型癥狀和腦脊髓炎型癥狀。嘔吐消耗型的臨床癥狀表現(xiàn)為嘔吐、腹瀉、吞咽困難,最終由于長期不進(jìn)食導(dǎo)致消瘦,機(jī)體機(jī)能衰竭而死亡,病死率在20%-80%之間。對于存活下來的仔豬,后期生長緩慢成為僵豬。腦脊髓炎型是在嘔吐消瘦型癥狀的基礎(chǔ)上發(fā)展而來的,主要侵襲3周齡以內(nèi)的仔豬,臨床表現(xiàn)為患病仔豬體溫上升,同時也伴有嘔吐,食欲減退,有明顯的神經(jīng)性癥狀,例如肌肉震顫、運(yùn)動失調(diào)、后肢僵直或麻痹成犬坐、四肢呈現(xiàn)劃水狀,對外界環(huán)境和聲音刺激異常敏感,發(fā)病后期出現(xiàn)眼球震顫、無法直立、呼吸困難,進(jìn)而導(dǎo)致死亡。該型發(fā)病時間短,死亡率高,只有少數(shù)會轉(zhuǎn)歸康復(fù),死亡率達(dá)20%-100%。該病自1952年首次在加拿大爆發(fā)后,日本、美國、歐洲等地均有感染此病的報(bào)道。1986年中國首次報(bào)道此病后,PHEV亦有增強(qiáng)趨勢,血清學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn),目前該病在東北地區(qū)多發(fā),并在吉林和遼寧有很高的感染率,所以制定有效的診斷與預(yù)防措施刻不容緩。目前對PHEV的檢測方法仍然以實(shí)驗(yàn)室診斷為主,需要專業(yè)的實(shí)驗(yàn)儀器并且對檢測人員的要求較高。所以建立一種快速、方便、敏感性及特異性強(qiáng)的診斷方法,成為研究人員亟待解決的課題。其中酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)最為符合我們診斷的需要。本研究通過對PHEV重組蛋白N的菌液的復(fù)蘇,參照最佳誘導(dǎo)條件進(jìn)行純化并成功獲得抗原,建立及優(yōu)化了Elisa方法,組建了豬血凝性腦脊髓炎病毒結(jié)構(gòu)蛋白N間接抗體檢測試劑盒,為今后的血清學(xué)調(diào)查提供依據(jù)。具體內(nèi)容如下:1 PHEV-N重組抗原蛋白的制備與質(zhì)量檢測參考本實(shí)驗(yàn)室優(yōu)化所得的最佳誘導(dǎo)條件進(jìn)行誘導(dǎo),大量制備目的蛋白,隨后用His Gravi Trap純化試劑盒對其進(jìn)行純化,并將純化后的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測,檢測蛋白的純度及濃度等。試驗(yàn)方法及結(jié)果如下:復(fù)蘇后的菌液按1:100接種到LB液體培養(yǎng)基中,置于37℃的恒溫?fù)u床內(nèi)200rmp搖晃2h后取出,按1:1000的比例加入100m M的IPTG誘導(dǎo)6小時,超聲破碎后進(jìn)行純化。取純化后產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測,于55k D處觀察到有明顯的條帶,且無雜帶,表明純化后蛋白的純度較高。取出所得的4批中的3批純化蛋白進(jìn)行蛋白濃度檢測,測得的平均濃度分別為122.497mg/m L、189.8887mg/m L、155.44257mg/m L。2 Elisa方法的建立及優(yōu)化用純化后的重組N蛋白包被Elisa酶標(biāo)板,建立Elisa方法并進(jìn)行優(yōu)化,并與HI方法進(jìn)行符合率的比較,所得結(jié)果如下:抗原的最佳包被濃度為0.0625μg/m L,血清的最佳稀釋度為1:200,最佳抗原包被時間為37℃2h+4℃過夜,最佳封閉劑為3%的脫脂奶,最佳封閉時間為37℃作用2h,血清最佳作用時間為90min,酶標(biāo)二抗最佳稀釋倍數(shù)為1:10000,酶標(biāo)二抗最佳反應(yīng)時間為37℃作用90min,底物的最佳反應(yīng)時間是室溫作用20min。隨后根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)原理計(jì)算得出當(dāng)血清OD450nm的值大于等于0.386判定為陽性,當(dāng)OD450nm的值小于0.320時判定為陰性,介于二者之間為可疑。用建立好的Elisa方法同時檢測PHEV、豬δ冠狀病毒(PDCo V)、豬偽狂犬病毒(PRV)、豬瘟病毒(CSFV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)的陽性血清,所得結(jié)果顯示除PHEV外其他病毒的血清均為陰性,表明本試驗(yàn)特異性良好,無交叉反應(yīng)。同時對其敏感度進(jìn)行測定,結(jié)果表明當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)陽性血清倍比稀釋到1:6400時,檢測結(jié)果仍為陽性,說明該方法敏感性良好。最后比較Elisa和HI方法二者的符合率為77.5%,結(jié)果也表明Elisa方法較HI方法敏感。3豬血凝性腦脊髓炎病毒間接Elisa抗體檢測試劑盒的研制及應(yīng)用在建立的Elisa方法基礎(chǔ)上,確定陰陽性對照血清,用純化后的重組蛋白制備酶標(biāo)板,組建3批Elisa抗體檢測試劑盒,對其批內(nèi)、批間重復(fù)性、保存期、敏感性、特異性等條件進(jìn)行檢測,最后應(yīng)用于臨床樣本的檢測。具體結(jié)果如下:對3批試劑盒進(jìn)行批間和批內(nèi)的測定實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)不同批次組裝的試劑盒,變異系數(shù)在3.43%-7.56%,均小于10%。三批組裝的試劑盒,隨機(jī)檢測4份不同抗體效價(jià)的血清,變異系數(shù)在1.09%-2.60%,均小于3%,表明試劑盒的批間和批內(nèi)檢測結(jié)果穩(wěn)定,重復(fù)性好。分別對三批試劑進(jìn)行敏感性測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)在血清稀釋度在1:6400時仍為陽性,隨后檢測PHEV、豬δ冠狀病毒(PDCo V)、豬偽狂犬病毒(PRV)、豬瘟病毒(CSFV)、豬圓環(huán)病毒(PCV)這5種病原的陽性血清,發(fā)現(xiàn)除PHEV外,其他豬病的血清均為陰性。同時對試劑盒的保存期進(jìn)行測試,發(fā)現(xiàn)該試劑盒在-20℃可以保存6個月。最后用已組裝好的豬血凝腦脊髓炎病毒間接Elisa抗體檢測試劑盒分別對采集自山東、吉林、遼寧、天津等地633份血清進(jìn)行檢測,調(diào)查發(fā)現(xiàn)各地陽性血清比例均占半數(shù)以上。綜上所述,本研發(fā)項(xiàng)目初步建立了PHEV抗體檢測試劑盒,且該試劑盒具有較高的敏感性、特異性和重復(fù)性,可用于PHEV免疫抗體的檢測與流行病學(xué)調(diào)查。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S858.28

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2638930