【摘要】：結(jié)核病(Tuberculosis)是一種慢性消耗性人畜共患傳染病,每年引發(fā)全球1000萬人,5000萬頭牛感染結(jié)核病,對社會公共衛(wèi)生安全及畜牧業(yè)存在巨大的威脅。結(jié)核病的病原菌主要為結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)及牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)。在牛分枝桿菌入侵宿主的過程中,受到宿主體內(nèi)多種免疫機制的圍剿,但其主要被巨噬細(xì)胞吞噬。牛分枝桿菌進(jìn)入巨噬細(xì)胞后可以通過自身毒力因子抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)的免疫機制,在巨噬細(xì)胞中潛伏,從而使其發(fā)生免疫逃避。在巨噬細(xì)胞與牛分枝桿菌互作的過程中,宿主細(xì)胞多種免疫機制發(fā)揮著重要作用,其中就包括組蛋白的乙�；{(diào)節(jié)。因此,本研究通過探討組蛋白去乙酰化酶抑制劑丁酸鈉對于THP-1巨噬細(xì)胞和C57BL/6小鼠抵抗牛分枝桿菌感染的影響,為探究結(jié)核病致病機理及其新藥物研發(fā)提供新的思路及理論基礎(chǔ)。具體試驗方法及結(jié)果如下:1.為了探究丁酸鈉對THP-1細(xì)胞抵抗牛分枝桿菌的影響,本試驗用牛分枝桿菌感染THP-1細(xì)胞3h后,移除胞外牛分枝桿菌之后分別用0.5mM、1.0mM 丁酸鈉處理24h,收取總蛋白、總RNA及上清液。進(jìn)行胞內(nèi)菌落形成單位(CFU)檢測,并用實時熒光定量PCR及WB檢測LL37、Ⅰ型HDAC、NFκB信號通路及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá),同時ELISA檢測細(xì)胞因子IL1β、IL10、TNF-α的分泌。結(jié)果顯示牛分枝桿菌感染后,丁酸鈉能夠促進(jìn)THP-1細(xì)胞LL37的表達(dá),抑制HDAC1、HDAC2及HDAC3的表達(dá)并抑制NFκB信號通路,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,細(xì)胞因子IL1β、TNF-α分泌減少,增強THP-1細(xì)胞清除胞內(nèi)牛分枝桿菌。2.為研究組蛋白去乙�；敢种苿┒∷徕c對于C57BL/6小鼠感染牛分枝桿菌的保護作用,本試驗分別用丁酸鈉進(jìn)行預(yù)防及治療試驗,在牛分枝桿菌感染C57BL/6小鼠前后,兩天一次進(jìn)行兩個濃度的丁酸鈉腹腔注射。之后通過觀察小鼠生存率及體重變化、臟器病理變化,并對小鼠進(jìn)行肺內(nèi)CFU、肺內(nèi)炎性細(xì)胞的聚集以及血清細(xì)胞因子進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示注射500 mg/kg 丁酸鈉后,受感染的小鼠存活率升高,肺內(nèi)細(xì)菌負(fù)擔(dān)比未注射丁酸鈉組減少,丁酸鈉注射組肺內(nèi)炎性細(xì)胞聚集降低,并且各臟器病變程度也較輕。綜上所述,本研究結(jié)果表明組蛋白去乙酰化酶抑制劑丁酸鈉能夠促進(jìn)THP-1巨噬細(xì)胞及C57BL/6小鼠抵抗牛分枝桿菌感染。這一結(jié)果證實組蛋白的乙�；{(diào)節(jié)能夠影響機體對牛分枝桿菌的抵抗作用,為抗結(jié)核新藥研發(fā)提供了思路。
【圖文】：

致命的傳染病。在２０１７年新發(fā)病例中５８０萬男性，３２０萬女性和１００萬兒童感染。其中新發(fā)病例逡逑主要被亞洲發(fā)展中國家占據(jù)，其中印度以２７％的新發(fā)病例居首位，其次為中國、印度尼西亞以及逡逑菲律賓。新發(fā)病例中僅有６％屬于ＷＨＯ成員國歐洲和美洲地區(qū)發(fā)達(dá)國家（如圖１－１所示）。在耐逡逑藥結(jié)核方面，在２０１７年度的耐利福平結(jié)核病（ＲＲ－ＴＢ）病例約占新發(fā)病例的５．５％，其中包括８２％逡逑－１邋－逡逑

Ｉｔ邐＊邋Ｖ逡逑導(dǎo)Ａ．~枊X！逡逑圖２－１牛分枝桿菌齊尼二氏抗酸染色（１０0ｘ）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ２－１邋Ｚｉｅｈｌ－Ｎｅｅｌｓｏｎ邋Ａｃｉｄ－ｆａｓｔ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ邋ｆｏｒ邋Ｍ．ｂｏｖｉｓ邋（１０0ｘ）逡逑２．３．２邋ＴＨＰ－１細(xì)胞誘導(dǎo)條件的摸索逡逑采用不同濃度的ＰＭＡ對ＴＨＰ－１細(xì)胞（圖２－２）進(jìn)行誘導(dǎo)使其貼壁，１２邋ｈ后換液，２４邋ｈ后觀察細(xì)逡逑胞狀態(tài)以選取最佳誘導(dǎo)濃度，結(jié)果如圖２－３所示，在ｌｎｇ／ｍＬ到１００ｎｇ／ｍＬ的ＰＭＡ濃度間，其均能使逡逑其貼壁。Ｉｎｇ／ｍＬＰＭＡ濃度發(fā)現(xiàn)細(xì)胞還為圓形，僅有幾乎無細(xì)胞伸出偽足；５ｎｇ／ｍＬ雖有細(xì)胞伸出逡逑偽足但數(shù)量較少。而２５邋ｎｇ／ｍＬ及以上的細(xì)胞細(xì)胞大小不一，部分細(xì)胞內(nèi)存在小空泡樣的存在，對逡逑細(xì)胞狀態(tài)存在一定的毒性影響。１０邋ｎｇ／ｍＬＰＭＡ刺激細(xì)胞２４邋ｈ后，細(xì)胞較多細(xì)胞伸出偽足，且分布逡逑均勻，分布較好，無特殊細(xì)胞病變。因此，本試驗采用１０邋ｎｇ／ｍＬ邋ＰＭＡ濃度刺激ＴＨＰ－１細(xì)胞，，待６０％逡逑左右的細(xì)胞伸出偽足即可進(jìn)行后續(xù)感染試驗。
【學(xué)位授予單位】：寧夏大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S855

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本文編號：2638915