【摘要】：骨骼肌維持運(yùn)動(dòng)功能并調(diào)節(jié)機(jī)體代謝,對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育和再生研究對(duì)于提高家畜的產(chǎn)肉量、提升肉品質(zhì)具有重要意義。肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2A(MEF2A)是肌生成過(guò)程中重要的轉(zhuǎn)錄因子,參與骨骼肌、心肌發(fā)育及骨骼肌的再生。已有的研究表明MEF2A缺失嚴(yán)重抑制骨骼肌成肌細(xì)胞分化和骨骼肌再生,但關(guān)于MEF2A能否調(diào)控成肌細(xì)胞的增殖尚無(wú)明確報(bào)道,并且MEF2A調(diào)控成肌細(xì)胞分化的下游靶點(diǎn)和信號(hào)通路機(jī)制尚不完全明確�；诖�,本學(xué)位論文課題以秦川牛為研究對(duì)象,系統(tǒng)研究了MEF2A對(duì)骨骼肌成肌細(xì)胞增殖和分化的調(diào)控作用及機(jī)理,旨在為秦川牛的肉用遺傳改良和分子育種提供理論基礎(chǔ),同時(shí)為大動(dòng)物中骨骼肌的生理和病理學(xué)研究提供支撐。主要研究結(jié)果如下:1.本研究利用二型膠原酶/中性蛋白酶聯(lián)合消化法及選擇培養(yǎng)基差速貼壁法成功從牛骨骼肌中分離得到高純度、高分化潛能的成肌細(xì)胞。RT-PCR結(jié)果顯示,MYOD1的表達(dá)量在成肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化的第0天至第6天逐漸上調(diào),之后表達(dá)量逐漸下降;MYF6、MYOG和MYH1的表達(dá)量則隨成肌細(xì)胞的分化逐漸升高。說(shuō)明本研究分離得到的骨骼肌成肌細(xì)胞完全滿(mǎn)足于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。2.在秦川牛從6月齡到24月齡生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中,MEF2A基因mRNA的表達(dá)量逐漸上升。在體外培養(yǎng)的成肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化的過(guò)程中,MEF2A基因mRNA和蛋白的表達(dá)量也均逐漸提高。該研究結(jié)果提示MEF2A的功能與秦川牛骨骼肌的生成和成肌細(xì)胞的分化密切相關(guān)。3.在成肌細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中,MEF2A過(guò)表達(dá)增加了增殖細(xì)胞比例,同時(shí)促使大量細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期。RT-PCR與Western blot結(jié)果顯示,MEF2A過(guò)表達(dá)顯著提高了PCNA、CCNA2、CCNE1、CCNE2等細(xì)胞增殖相關(guān)基因mRNA的表達(dá)水平和PCNA、CDK2蛋白表達(dá)水平。4.MEF2A表達(dá)水平的精準(zhǔn)調(diào)控是維持成肌細(xì)胞分化所必需。MEF2A沉默抑制成肌細(xì)胞分化,并顯著下調(diào)MYOZ2表達(dá)量。通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告載體活性檢測(cè),本研究發(fā)現(xiàn)MEF2A可以直接促進(jìn)MYOZ2基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性,而MYOZ2沉默后也顯著抑制了成肌細(xì)胞的分化。相反,MEF2A過(guò)表達(dá)則引發(fā)嚴(yán)重的細(xì)胞凋亡。5.在成肌細(xì)胞分化過(guò)程中,MEF2A沉默后抑制MEG3基因的表達(dá),同時(shí)抑制MEG3/DIO3位點(diǎn)miR-758和miR-543的表達(dá),miR-758和miR-543的下調(diào)解除了其對(duì)PPP2R2C基因的轉(zhuǎn)錄抑制,使得PPP2R2C的表達(dá)量得以上調(diào),進(jìn)而激活了PP2A信號(hào)通路,抑制成肌細(xì)胞分化。綜上,MEF2A是骨骼肌生成過(guò)程中的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白,MEF2A不僅能夠促進(jìn)成肌細(xì)胞的增殖,同時(shí),MEF2A表達(dá)水平的精準(zhǔn)調(diào)控是維持成肌細(xì)胞分化所必需,MEF2A敲低或過(guò)表達(dá)均抑制成肌細(xì)胞分化。此外,本研究利用體外培養(yǎng)細(xì)胞系統(tǒng)研究MEF2A調(diào)控成肌細(xì)胞分化機(jī)制,揭示MEF2A可直接通過(guò)MYOZ2和MEG3/DIO3-PP2A兩條信號(hào)通路調(diào)控成肌細(xì)胞的分化。本課題為在大動(dòng)物中研究骨骼肌的生長(zhǎng)發(fā)育提供了借鑒,同時(shí)為通過(guò)調(diào)節(jié)成肌細(xì)胞的增殖和分化實(shí)現(xiàn)秦川牛的肉用遺傳改良和分子育種提供了新的思路。
【圖文】：

2圖 1-1 骨骼肌的起源與發(fā)育（Buckingham and Relaix 2007）Figure 1-1 Developmental origin of skeletal muscle（Buckingham and Relaix 2007）后骨骼肌的生長(zhǎng)發(fā)育生后，骨骼肌為適應(yīng)新的環(huán)境要求會(huì)在應(yīng)激能力、收縮能力、和類(lèi)型以及肌肉重量等方面發(fā)生一系列生理適應(yīng)性變化，這種（remodelling）（Braun and Gautel 2011）。骨骼肌的重塑過(guò)程合成、蛋白質(zhì)降解以及代謝變化。到目前為止，對(duì)骨骼肌重塑纖維類(lèi)型的形成和轉(zhuǎn)化以及肌肉生長(zhǎng)調(diào)控。維類(lèi)型的形成和轉(zhuǎn)化體骨骼肌組織包含兩類(lèi)高度分化的肌纖維類(lèi)型：慢縮型肌纖cle fiber），又叫氧化型肌纖維（oxidative fibre type）或 I 型肌

1.1.3.3 骨骼肌的損傷修復(fù)骨骼肌的損傷修復(fù)是一個(gè)復(fù)雜有序的過(guò)程（圖 1-2）。正常生理過(guò)程中，骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞中約有 10% 的細(xì)胞用以維持和更新骨骼肌的干細(xì)胞庫(kù)，不參與分化過(guò)程，這些細(xì)胞高表達(dá) PAX7 蛋白。其余的約 90% 的細(xì)胞具有成肌定向分化潛能，可被PAX7 和 MYF5 同時(shí)標(biāo)記（PAX7+MYF5+）（Wang and Rudnicki 2011）。當(dāng)肌肉發(fā)生損傷時(shí)，PAX7+MYF5+肌衛(wèi)星細(xì)胞會(huì)被激活，并迅速大量增殖，MYOD1（myogenicdifferentiation 1）的表達(dá)量也迅速上調(diào)。上調(diào)的 MYOD1 作為肌細(xì)胞分化決定因子會(huì)使部分 PAX7+MYF5+肌衛(wèi)星細(xì)胞定向分化為成肌細(xì)胞（PAX7+MYF5+MYOD1+）。其余的 PAX7+MYF5+MYOD1-成肌細(xì)胞則恢復(fù)到靜息狀態(tài)，維持肌衛(wèi)星細(xì)胞庫(kù)的穩(wěn)定（Bengal 2017）。被活化的 PAX7+MYF5+MYOD1+成肌細(xì)胞會(huì)進(jìn)一步增殖分化為成熟肌細(xì)胞。成熟肌細(xì)胞中 PAX7 表達(dá)量降低，MYOG（ myogenin）、MYF6 和 MYH（myosin heavy chain）的表達(dá)量上升。成熟的肌細(xì)胞會(huì)進(jìn)一步融合形成具有收縮功能的多核肌纖維，修復(fù)受損的肌肉組織（Almada and Wagers 2016; Wang and Rudnicki2011）。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：S823

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本文編號(hào)：2638316