【摘要】：H9N2亞型禽流感病毒(Avain influenza virus,AIV)在全世界廣泛分布,雞感染H9N2 AIV后易繼發(fā)大腸桿菌病,這是我國養(yǎng)禽業(yè)普遍面臨的難題之一。目前,關(guān)于H9N2 AIV感染后繼發(fā)大腸桿菌病的機制還不清楚。近年來,轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-Seq)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于病毒感染宿主細胞的發(fā)病機制研究中。本研究利用RNA-Seq技術(shù)檢測了H9N2 AIV感染與脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)刺激雞巨噬細胞(HD11細胞)mRNA表達譜的變化,篩選到與炎癥相關(guān)的基因,進一步闡明其與炎癥信號通路的相互關(guān)系。具體研究內(nèi)容如下:(1)H9N2 AIV與LPS感染/刺激HD11細胞后轉(zhuǎn)錄組分析及驗證。試驗設(shè)置為5組:對照組、H9N2 AIV感染HD11細胞(H9N2組)、H9N2 AIV感染HD11細胞并同時添加LPS對其形成共刺激(共感染組)、H9N2 AIV感染HD11細胞24 h后添加LPS刺激8 h(繼發(fā)感染組)這五組進行分析及驗證。結(jié)果發(fā)現(xiàn),繼發(fā)感染與共感染后出現(xiàn)的細胞病變比單獨H9N2 AIV感染明顯。繼發(fā)感染組中NS1蛋白的表達顯著高于H9N2組,共感染組NS1蛋白的表達顯著低于繼發(fā)感染組。將上述5組細胞收取RNA樣品后進行RNA-Seq。H9N2組、繼發(fā)感染組與共感染組篩選到的上調(diào)基因與下調(diào)基因數(shù)量不同,其中共感染組篩選到的差異表達基因最多,有447個基因上調(diào),157個基因下調(diào)。利用GO和KEGG Pathway對所篩選到的差異基因進行分析,顯示這些差異基因主要聚焦于免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)及MAPK、NF-κB等信號通路。為了驗證RNA-Seq技術(shù)的準確性,我們選取6個與炎癥相關(guān)的基因進行熒光定量PCR(RT-qPCR)驗證,包括IFN-α、IL-10、IL-8、TNF-α、IL-12B與CXCL12。結(jié)果發(fā)現(xiàn)RT-qPCR與RNA-Seq結(jié)果基本一致,初步肯定了測序結(jié)果的準確性,為下一步對炎癥信號通路影響的研究奠定基礎(chǔ)。(2)H9N2 AIV與LPS感染/刺激HD11細胞后炎癥信號通路的變化。利用免疫印跡方法對MAPK與NF-κB信號通路的關(guān)鍵蛋白進行檢測。其中,MAPK通路的三個關(guān)鍵蛋白(p38、JNK、ERK)發(fā)生磷酸化,共感染組的磷酸化水平最顯著;p65發(fā)生磷酸化,IκBα降解,其中共感染組顯著降解。表明H9N2 AIV感染與LPS刺激HD11細胞能夠激活MAPK與NF-κB信號通路。此外,進一步研究發(fā)現(xiàn),H9N2 AIV感染與LPS刺激HD11細胞后,使用p38抑制劑SB203580作用細胞,IFN-α、IL-10在抑制劑處理前后發(fā)生顯著變化,表明通過p38通路促進了IFN-α、IL-10的分泌;使用JNK抑制劑SP600125作用細胞,炎癥相關(guān)基因在處理前后未發(fā)生顯著變化,表明IFN-α、IL-10、CXCL12、TNF-α與IL-8不通過JNK通路產(chǎn)生;使用ERK抑制劑SCH772984處理細胞,IL-8在處理前后發(fā)生顯著變化,表明ERK通路抑制IL-8分泌;利用NF-κB抑制劑BAY11-7082處理細胞,IFN-α、IL-10、CXCL12、TNF-α與IL-8在處理前后變化顯著,說明通過NF-κB信號通路促進IFN-α、IL-10、CXCL12、TNF-α,而抑制IL-8分泌。闡明IFN-α、IL-8、IL-10、TNF-α、CXCL12、IL-12B與MAPK、NF-κB信號通路的相互關(guān)系。綜上所述,本研究通過RNA-Seq技術(shù)篩選得到了H9N2 AIV與LPS感染/刺激HD11細胞后差異表達的胞內(nèi)基因,這些差異基因有助于解析H9N2 AIV感染與大腸桿菌感染之間的關(guān)系。進一步研究表明,在繼發(fā)感染與共感染過程中通過MAPK與NF-κB通路對炎癥相關(guān)基因有調(diào)節(jié)作用。研究結(jié)果對揭示雞感染H9N2 AIV后繼發(fā)大腸桿菌病的分子機制提供了有用的實驗數(shù)據(jù),為臨床上制定H9N2 AIV以及繼發(fā)產(chǎn)生的大腸桿菌感染的防治策略提供一定的科學依據(jù)。
【學位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S855.3

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本文編號：2637971