【摘要】：H9N2亞型禽流感病毒(Avain influenza virus,AIV)在全世界廣泛分布,雞感染H9N2 AIV后易繼發(fā)大腸桿菌病,這是我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)普遍面臨的難題之一。目前,關(guān)于H9N2 AIV感染后繼發(fā)大腸桿菌病的機(jī)制還不清楚。近年來(lái),轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-Seq)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于病毒感染宿主細(xì)胞的發(fā)病機(jī)制研究中。本研究利用RNA-Seq技術(shù)檢測(cè)了H9N2 AIV感染與脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)刺激雞巨噬細(xì)胞(HD11細(xì)胞)mRNA表達(dá)譜的變化,篩選到與炎癥相關(guān)的基因,進(jìn)一步闡明其與炎癥信號(hào)通路的相互關(guān)系。具體研究?jī)?nèi)容如下:(1)H9N2 AIV與LPS感染/刺激HD11細(xì)胞后轉(zhuǎn)錄組分析及驗(yàn)證。試驗(yàn)設(shè)置為5組:對(duì)照組、H9N2 AIV感染HD11細(xì)胞(H9N2組)、H9N2 AIV感染HD11細(xì)胞并同時(shí)添加LPS對(duì)其形成共刺激(共感染組)、H9N2 AIV感染HD11細(xì)胞24 h后添加LPS刺激8 h(繼發(fā)感染組)這五組進(jìn)行分析及驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn),繼發(fā)感染與共感染后出現(xiàn)的細(xì)胞病變比單獨(dú)H9N2 AIV感染明顯。繼發(fā)感染組中NS1蛋白的表達(dá)顯著高于H9N2組,共感染組NS1蛋白的表達(dá)顯著低于繼發(fā)感染組。將上述5組細(xì)胞收取RNA樣品后進(jìn)行RNA-Seq。H9N2組、繼發(fā)感染組與共感染組篩選到的上調(diào)基因與下調(diào)基因數(shù)量不同,其中共感染組篩選到的差異表達(dá)基因最多,有447個(gè)基因上調(diào),157個(gè)基因下調(diào)。利用GO和KEGG Pathway對(duì)所篩選到的差異基因進(jìn)行分析,顯示這些差異基因主要聚焦于免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)及MAPK、NF-κB等信號(hào)通路。為了驗(yàn)證RNA-Seq技術(shù)的準(zhǔn)確性,我們選取6個(gè)與炎癥相關(guān)的基因進(jìn)行熒光定量PCR(RT-qPCR)驗(yàn)證,包括IFN-α、IL-10、IL-8、TNF-α、IL-12B與CXCL12。結(jié)果發(fā)現(xiàn)RT-qPCR與RNA-Seq結(jié)果基本一致,初步肯定了測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性,為下一步對(duì)炎癥信號(hào)通路影響的研究奠定基礎(chǔ)。(2)H9N2 AIV與LPS感染/刺激HD11細(xì)胞后炎癥信號(hào)通路的變化。利用免疫印跡方法對(duì)MAPK與NF-κB信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白進(jìn)行檢測(cè)。其中,MAPK通路的三個(gè)關(guān)鍵蛋白(p38、JNK、ERK)發(fā)生磷酸化,共感染組的磷酸化水平最顯著;p65發(fā)生磷酸化,IκBα降解,其中共感染組顯著降解。表明H9N2 AIV感染與LPS刺激HD11細(xì)胞能夠激活MAPK與NF-κB信號(hào)通路。此外,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),H9N2 AIV感染與LPS刺激HD11細(xì)胞后,使用p38抑制劑SB203580作用細(xì)胞,IFN-α、IL-10在抑制劑處理前后發(fā)生顯著變化,表明通過(guò)p38通路促進(jìn)了IFN-α、IL-10的分泌;使用JNK抑制劑SP600125作用細(xì)胞,炎癥相關(guān)基因在處理前后未發(fā)生顯著變化,表明IFN-α、IL-10、CXCL12、TNF-α與IL-8不通過(guò)JNK通路產(chǎn)生;使用ERK抑制劑SCH772984處理細(xì)胞,IL-8在處理前后發(fā)生顯著變化,表明ERK通路抑制IL-8分泌;利用NF-κB抑制劑BAY11-7082處理細(xì)胞,IFN-α、IL-10、CXCL12、TNF-α與IL-8在處理前后變化顯著,說(shuō)明通過(guò)NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)IFN-α、IL-10、CXCL12、TNF-α,而抑制IL-8分泌。闡明IFN-α、IL-8、IL-10、TNF-α、CXCL12、IL-12B與MAPK、NF-κB信號(hào)通路的相互關(guān)系。綜上所述,本研究通過(guò)RNA-Seq技術(shù)篩選得到了H9N2 AIV與LPS感染/刺激HD11細(xì)胞后差異表達(dá)的胞內(nèi)基因,這些差異基因有助于解析H9N2 AIV感染與大腸桿菌感染之間的關(guān)系。進(jìn)一步研究表明,在繼發(fā)感染與共感染過(guò)程中通過(guò)MAPK與NF-κB通路對(duì)炎癥相關(guān)基因有調(diào)節(jié)作用。研究結(jié)果對(duì)揭示雞感染H9N2 AIV后繼發(fā)大腸桿菌病的分子機(jī)制提供了有用的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),為臨床上制定H9N2 AIV以及繼發(fā)產(chǎn)生的大腸桿菌感染的防治策略提供一定的科學(xué)依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S855.3

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本文編號(hào)：2637971