【摘要】：PTN(pleiotrophin)是1989年從牛子宮中發(fā)現(xiàn)并提純的一種生長(zhǎng)因子,與肝素具有較高的親和性。隨著研究的不斷深入,發(fā)現(xiàn)該因子分布廣泛且具有多重生物活性,故而后期重新命名為多效生長(zhǎng)因子。PTN是一個(gè)擁有168個(gè)氨基酸的蛋白,包含32個(gè)氨基酸殘基組成的信號(hào)肽,在不同種屬間高度保守�，F(xiàn)有研究表明PTN在癌細(xì)胞增殖中也扮演著重要角色。鹿茸再生以及神奇的增殖速度是自然界非常罕見(jiàn)的,因此也成為科學(xué)研究的熱點(diǎn),有相關(guān)學(xué)者認(rèn)為鹿茸角再生機(jī)制是再生生物學(xué)研究的理想模型,并且對(duì)鹿茸角增殖機(jī)理的研究也有可能成為癌癥治療新的突破點(diǎn)。本試驗(yàn)根據(jù)Genbank中同源物種牛的基因序列設(shè)計(jì)了 PTN基因帶酶切位點(diǎn)的同源引物。采用RT-PCR技術(shù)、分子克隆技術(shù)成功獲得梅花鹿鹿茸組織PTN基因cDNA序列,通過(guò)對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行核苷酸和氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn),PTN基因cDNA序列長(zhǎng)750bp,共編碼168個(gè)氨基酸,經(jīng)NCBI中Blast功能比對(duì),結(jié)果顯示梅花鹿PTN基因與白尾鹿、牛、綿羊同源性較高,核酸序列分別為98%、97%、96%,證明該基因在進(jìn)化上相對(duì)比較保守,符合功能基因特點(diǎn)。運(yùn)用MEGA5.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示梅花鹿與白尾鹿、牛、綿羊等偶蹄目動(dòng)物進(jìn)化關(guān)系較近,與人、普氏野馬、北非果蝠親緣關(guān)系較遠(yuǎn),這一進(jìn)化特點(diǎn)也符合經(jīng)典分類學(xué)觀點(diǎn),從側(cè)面反映了本研究結(jié)果的可靠性。Real-time PCR 檢測(cè) PTN 基因在鹿茸間充質(zhì)組織不同時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量,結(jié)果顯示中期表達(dá)量比前期和后期都高。將pMD-18T-PTN菌液活化后提取質(zhì)粒,經(jīng)雙酶切后與同樣經(jīng)過(guò)雙酶切的真核表達(dá)載體pEGFP-C1連接,構(gòu)建重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到DH5α細(xì)胞中,經(jīng)PCR和雙酶切鑒定分析,成功構(gòu)建pEGFP-C1-PTN真核表達(dá)載體。將其瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到復(fù)蘇培養(yǎng)傳代2次生長(zhǎng)良好的293T細(xì)胞中,熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光,證明轉(zhuǎn)染成功。對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞同時(shí)進(jìn)行RNA提取,通過(guò)Real-time PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),PTN在實(shí)驗(yàn)組的表達(dá)量是對(duì)照組的約16倍,說(shuō)明pEGFP-C1-PTN真核表達(dá)載體在293T細(xì)胞里成功表達(dá)。Real-time PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)當(dāng)梅花鹿PTN基因在293T細(xì)胞中過(guò)表達(dá)時(shí),HOXA5、MMP3、MMP10 mRNA表達(dá)水平均顯著下降,EGF基因mRNA表達(dá)水平有顯著上調(diào)。
【圖文】：

中ＰＴＮ濃度明顯高于正常對(duì)照，，從幾十到幾百增高倍數(shù)不等；在腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤、肝細(xì)逡逑胞癌、喉淲癌和胰腺癌等不同部位的惡性腫瘤中ＰＴＮ基因表達(dá)同樣均明顯高于正常對(duì)逡逑照［３５］。如圖１－２ＰＴＮ基因在癌組織與正常組織中的表達(dá)豐度圖可見(jiàn)，ＰＴＮ基因在多種癌逡逑組織中過(guò)量表達(dá)，而在正常組織中表達(dá)較少甚至不表達(dá)，例如皮膚黑色素瘤Ｓｋｉｎ逡逑Ｃｕｔａｎｅｏｕｓ邋Ｍｅｌａｎｏｍａ（ＳＫＣＭ）中ＰＴＮ的表達(dá)量是正常組織中的８００多倍，在嗜鉻細(xì)胞瘤逡逑和副神經(jīng)節(jié)瘤Ｐｈｅｏｃｈｒｏｍｏｃｙｔｏｍａ邋ａｎｄ邋Ｐａｒａｇａｎｇｌｉｏｍａ（ＰＣＰＧ）中是近２５倍，而在腦低級(jí)神逡逑經(jīng)膠質(zhì)瘤Ｂｒａｉｎ邋Ｌｏｗｅｒ邋Ｇｒａｄｅ邋Ｇｌｉｏｍａ（ＬＧＧ）中ＰＴＮ的表達(dá)平均值為７４８３．７６，在正常組織逡逑中卻沒(méi)有表達(dá)。研宄還發(fā)現(xiàn)，外源性ＰＴＮ基因的導(dǎo)入能夠使ＮＩＨ３Ｔ３細(xì)胞和ＳＷ１３細(xì)逡逑胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，而能夠表達(dá)ＰＴＮ基因的細(xì)胞可以在軟瓊脂上產(chǎn)生克隆自主生長(zhǎng)［３６］。逡逑在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中，ＰＴＮ基因及其受體的表達(dá)量與細(xì)胞惡性程度呈正相關(guān)［３７］。這些都提逡逑示ＰＴＮ基因是與惡性腫瘤細(xì)胞的形成和生長(zhǎng)廣泛相關(guān)的調(diào)控基因

、逡逑＿．＾邋—－？￣邋＇ｃ逡逑圖１－１邋ＰＴＮ的多種生物功能［３４］逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋ｖａｒｉｏｕｓ邋ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ邋ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ邋ｏｆＰＴＮ逡逑１．２．２邋ＰＴＮ與腫瘤的相關(guān)性逡逑研宄人員在近些年對(duì)多種腫瘤的研宄中發(fā)現(xiàn)，在胃癌、胰腺癌、結(jié)腸癌患者的血清逡逑中ＰＴＮ濃度明顯高于正常對(duì)照，從幾十到幾百增高倍數(shù)不等；在腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤、肝細(xì)逡逑胞癌、喉淲癌和胰腺癌等不同部位的惡性腫瘤中ＰＴＮ基因表達(dá)同樣均明顯高于正常對(duì)逡逑照［３５］。如圖１－２ＰＴＮ基因在癌組織與正常組織中的表達(dá)豐度圖可見(jiàn)，ＰＴＮ基因在多種癌逡逑組織中過(guò)量表達(dá)，而在正常組織中表達(dá)較少甚至不表達(dá)，例如皮膚黑色素瘤Ｓｋｉｎ逡逑Ｃｕｔａｎｅｏｕｓ邋Ｍｅｌａｎｏｍａ（ＳＫＣＭ）中ＰＴＮ的表達(dá)量是正常組織中的８００多倍，在嗜鉻細(xì)胞瘤逡逑和副神經(jīng)節(jié)瘤Ｐｈｅｏｃｈｒｏｍｏｃｙｔｏｍａ邋ａｎｄ邋Ｐａｒａｇａｎｇｌｉｏｍａ（ＰＣＰＧ）中是近２５倍，而在腦低級(jí)神逡逑經(jīng)膠質(zhì)瘤Ｂｒａｉｎ邋Ｌｏｗｅｒ邋Ｇｒａｄｅ邋Ｇｌｉｏｍａ（ＬＧＧ）中ＰＴＮ的表達(dá)平均值為７４８３．７６，在正常組織逡逑中卻沒(méi)有表達(dá)。研宄還發(fā)現(xiàn)
【學(xué)位授予單位】：東北林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S825

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2637889