【摘要】：PTN(pleiotrophin)是1989年從牛子宮中發(fā)現(xiàn)并提純的一種生長因子,與肝素具有較高的親和性。隨著研究的不斷深入,發(fā)現(xiàn)該因子分布廣泛且具有多重生物活性,故而后期重新命名為多效生長因子。PTN是一個擁有168個氨基酸的蛋白,包含32個氨基酸殘基組成的信號肽,在不同種屬間高度保守�，F(xiàn)有研究表明PTN在癌細胞增殖中也扮演著重要角色。鹿茸再生以及神奇的增殖速度是自然界非常罕見的,因此也成為科學研究的熱點,有相關(guān)學者認為鹿茸角再生機制是再生生物學研究的理想模型,并且對鹿茸角增殖機理的研究也有可能成為癌癥治療新的突破點。本試驗根據(jù)Genbank中同源物種牛的基因序列設計了 PTN基因帶酶切位點的同源引物。采用RT-PCR技術(shù)、分子克隆技術(shù)成功獲得梅花鹿鹿茸組織PTN基因cDNA序列,通過對測序結(jié)果進行核苷酸和氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn),PTN基因cDNA序列長750bp,共編碼168個氨基酸,經(jīng)NCBI中Blast功能比對,結(jié)果顯示梅花鹿PTN基因與白尾鹿、牛、綿羊同源性較高,核酸序列分別為98%、97%、96%,證明該基因在進化上相對比較保守,符合功能基因特點。運用MEGA5.0構(gòu)建系統(tǒng)進化樹顯示梅花鹿與白尾鹿、牛、綿羊等偶蹄目動物進化關(guān)系較近,與人、普氏野馬、北非果蝠親緣關(guān)系較遠,這一進化特點也符合經(jīng)典分類學觀點,從側(cè)面反映了本研究結(jié)果的可靠性。Real-time PCR 檢測 PTN 基因在鹿茸間充質(zhì)組織不同時期的相對表達量,結(jié)果顯示中期表達量比前期和后期都高。將pMD-18T-PTN菌液活化后提取質(zhì)粒,經(jīng)雙酶切后與同樣經(jīng)過雙酶切的真核表達載體pEGFP-C1連接,構(gòu)建重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到DH5α細胞中,經(jīng)PCR和雙酶切鑒定分析,成功構(gòu)建pEGFP-C1-PTN真核表達載體。將其瞬時轉(zhuǎn)染到復蘇培養(yǎng)傳代2次生長良好的293T細胞中,熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光,證明轉(zhuǎn)染成功。對實驗組和對照組細胞同時進行RNA提取,通過Real-time PCR檢測發(fā)現(xiàn),PTN在實驗組的表達量是對照組的約16倍,說明pEGFP-C1-PTN真核表達載體在293T細胞里成功表達。Real-time PCR檢測發(fā)現(xiàn)當梅花鹿PTN基因在293T細胞中過表達時,HOXA5、MMP3、MMP10 mRNA表達水平均顯著下降,EGF基因mRNA表達水平有顯著上調(diào)。
【圖文】：

中ＰＴＮ濃度明顯高于正常對照，，從幾十到幾百增高倍數(shù)不等；在腦膠質(zhì)細胞瘤、肝細逡逑胞癌、喉淲癌和胰腺癌等不同部位的惡性腫瘤中ＰＴＮ基因表達同樣均明顯高于正常對逡逑照［３５］。如圖１－２ＰＴＮ基因在癌組織與正常組織中的表達豐度圖可見，ＰＴＮ基因在多種癌逡逑組織中過量表達，而在正常組織中表達較少甚至不表達，例如皮膚黑色素瘤Ｓｋｉｎ逡逑Ｃｕｔａｎｅｏｕｓ邋Ｍｅｌａｎｏｍａ（ＳＫＣＭ）中ＰＴＮ的表達量是正常組織中的８００多倍，在嗜鉻細胞瘤逡逑和副神經(jīng)節(jié)瘤Ｐｈｅｏｃｈｒｏｍｏｃｙｔｏｍａ邋ａｎｄ邋Ｐａｒａｇａｎｇｌｉｏｍａ（ＰＣＰＧ）中是近２５倍，而在腦低級神逡逑經(jīng)膠質(zhì)瘤Ｂｒａｉｎ邋Ｌｏｗｅｒ邋Ｇｒａｄｅ邋Ｇｌｉｏｍａ（ＬＧＧ）中ＰＴＮ的表達平均值為７４８３．７６，在正常組織逡逑中卻沒有表達。研宄還發(fā)現(xiàn)，外源性ＰＴＮ基因的導入能夠使ＮＩＨ３Ｔ３細胞和ＳＷ１３細逡逑胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，而能夠表達ＰＴＮ基因的細胞可以在軟瓊脂上產(chǎn)生克隆自主生長［３６］。逡逑在神經(jīng)母細胞瘤中，ＰＴＮ基因及其受體的表達量與細胞惡性程度呈正相關(guān)［３７］。這些都提逡逑示ＰＴＮ基因是與惡性腫瘤細胞的形成和生長廣泛相關(guān)的調(diào)控基因

、逡逑＿．＾邋—－？￣邋＇ｃ逡逑圖１－１邋ＰＴＮ的多種生物功能［３４］逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋ｖａｒｉｏｕｓ邋ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ邋ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ邋ｏｆＰＴＮ逡逑１．２．２邋ＰＴＮ與腫瘤的相關(guān)性逡逑研宄人員在近些年對多種腫瘤的研宄中發(fā)現(xiàn)，在胃癌、胰腺癌、結(jié)腸癌患者的血清逡逑中ＰＴＮ濃度明顯高于正常對照，從幾十到幾百增高倍數(shù)不等；在腦膠質(zhì)細胞瘤、肝細逡逑胞癌、喉淲癌和胰腺癌等不同部位的惡性腫瘤中ＰＴＮ基因表達同樣均明顯高于正常對逡逑照［３５］。如圖１－２ＰＴＮ基因在癌組織與正常組織中的表達豐度圖可見，ＰＴＮ基因在多種癌逡逑組織中過量表達，而在正常組織中表達較少甚至不表達，例如皮膚黑色素瘤Ｓｋｉｎ逡逑Ｃｕｔａｎｅｏｕｓ邋Ｍｅｌａｎｏｍａ（ＳＫＣＭ）中ＰＴＮ的表達量是正常組織中的８００多倍，在嗜鉻細胞瘤逡逑和副神經(jīng)節(jié)瘤Ｐｈｅｏｃｈｒｏｍｏｃｙｔｏｍａ邋ａｎｄ邋Ｐａｒａｇａｎｇｌｉｏｍａ（ＰＣＰＧ）中是近２５倍，而在腦低級神逡逑經(jīng)膠質(zhì)瘤Ｂｒａｉｎ邋Ｌｏｗｅｒ邋Ｇｒａｄｅ邋Ｇｌｉｏｍａ（ＬＧＧ）中ＰＴＮ的表達平均值為７４８３．７６，在正常組織逡逑中卻沒有表達。研宄還發(fā)現(xiàn)
【學位授予單位】：東北林業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S825

【參考文獻】

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本文編號：2637889