【摘要】：隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究水平的不斷提升,我國(guó)肉牛育種逐漸跨入新興生物技術(shù)育種階段。肌肉發(fā)育作為肉牛生產(chǎn)當(dāng)中最受關(guān)注的環(huán)節(jié)之一,其研究也在逐步深入,從DNA水平的分子標(biāo)記輔助選育轉(zhuǎn)向mRNA水平的關(guān)鍵基因功能研究,進(jìn)而擴(kuò)展到表觀(guān)遺傳層面的非編碼RNA調(diào)節(jié)機(jī)制研究。miRNA作為一種小片段非編碼RNA,其經(jīng)典作用方式為通過(guò)靶向結(jié)合mRNA 3’-UTR區(qū)調(diào)節(jié)相關(guān)生物學(xué)功能。近年來(lái),研究發(fā)現(xiàn)了眾多能夠參與肌肉發(fā)育相關(guān)功能調(diào)節(jié)的miRNA,但關(guān)于是否存在物種間保守調(diào)控肌肉發(fā)育的相關(guān)miRNA未見(jiàn)報(bào)道。因此,本研究根據(jù)已有不同物種(牛、大鼠、山羊和豬)的肌肉組織miRNA高通量測(cè)序結(jié)果,通過(guò)韋恩分析發(fā)現(xiàn)miR-24-3p可能是一個(gè)潛在能夠保守調(diào)控肌肉發(fā)育的miRNA。為確認(rèn)其在肌肉發(fā)育過(guò)程中的生物學(xué)功能,分別在小鼠C2C12細(xì)胞系和牛原代肌肉細(xì)胞中進(jìn)行了驗(yàn)證。為進(jìn)一步探明其保守性調(diào)控機(jī)制,對(duì)miR-24-3p和物種間共有靶標(biāo)的靶向關(guān)系進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)驗(yàn)證,闡明miR-24-3p在物種間通過(guò)廣泛性調(diào)節(jié)共有靶基因群調(diào)控肌肉發(fā)育相關(guān)生物學(xué)過(guò)程的分子機(jī)制。主要結(jié)果如下:1.采用已有牛、大鼠、山羊和豬的肌肉組織miRNA轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行韋恩分析,篩選得到miR-24-3p可能是一個(gè)在物種間保守性調(diào)控肌肉發(fā)育的潛在靶標(biāo)。2.以C2C12細(xì)胞為模型,過(guò)表達(dá)或者抑制細(xì)胞中mmu-miR-24-3p的表達(dá),通過(guò)CCK-8與qRT-PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn),mmu-miR-24-3p可以通過(guò)調(diào)控肌肉發(fā)育過(guò)程中的關(guān)鍵增殖與凋亡基因正向調(diào)控C2C12細(xì)胞增殖與凋亡。3.以牛肌肉原代細(xì)胞為模型,過(guò)表達(dá)或者抑制細(xì)胞中bta-miR-24-3p的表達(dá),通過(guò)CCK-8與qRT-PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn),bta-miR-24-3p也可以通過(guò)調(diào)控肌肉發(fā)育過(guò)程中的關(guān)鍵增殖與凋亡基因正向調(diào)控牛肌肉原代細(xì)胞增殖與凋亡。4.利用Targetsan軟件預(yù)測(cè)牛、小鼠、大鼠和人四個(gè)物種miR-24-3p的靶基因,韋恩分析發(fā)現(xiàn)四個(gè)物種間存在極大比例的共有靶基因,通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)和qRT-PCR技術(shù)對(duì)其中肌肉發(fā)育相關(guān)靶基因進(jìn)行驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)miR-24-3p可以對(duì)多數(shù)預(yù)測(cè)靶基因3’-UTR區(qū)進(jìn)行調(diào)控。綜上所述,本研究首次從物種間保守性調(diào)控肌肉發(fā)育miRNA為切入點(diǎn),發(fā)現(xiàn)miR-24-3p具有在物種間保守性調(diào)節(jié)肌肉發(fā)育的功能。對(duì)其分子機(jī)制進(jìn)行探究發(fā)現(xiàn),miR-24-3p對(duì)肌肉發(fā)育的物種間保守性調(diào)控可能是通過(guò)對(duì)其大規(guī)模共有靶基因的網(wǎng)絡(luò)性調(diào)控實(shí)現(xiàn)的。本研究為深入開(kāi)展miRNA對(duì)肌肉發(fā)育的調(diào)控研究提供了一種新的思路,為肉牛育種工作提供了一定的理論和科學(xué)依據(jù)。
【圖文】：

-1 四個(gè)物種肌肉組織高表達(dá)前 100 位 miRNA 韋恩分iagram of the top 100 miRNA expression in muscle tissu-3 四個(gè)物種肌肉組織高表達(dá)前 100 位 miRNA 韋恩分 table of the top 100 miRNA expression in muscle tissue數(shù)量NumbermiRNA 列表miRNA list3 miR-199a-3p, miR-24-3p, miR-30a-5p3 miR-133b, miR-1, miR-2062 miR-22-3p, miR-423-5p4 let-7a-5p, miR-99a-5p, miR-21-5p, miR-27a-310let-7d-5p, miR-532-5p, miR-133a-3p, miR-140miR-30c-5p, miR-10a-5p, miR-27b-3p, miR-3030miR-92a, let-7i, miR-98, miR-100, miR-17-5pmiR-30d, miR-125b, miR-103, let-7c, miR-185miR-378, miR-186, miR-23a, let-7g, miR-152,miR-193a-5p, miR-181a, miR-127, let-7e, miRmiR-29a, miR-191, miR-128, miR-26a3 miR-92b, miR-660, miR-196a

18圖 2-3 不同物種間 mir-24 序列比對(duì)圖Fig. 2-3 Multiple sequence alignment of mir-24 sequences in different species通過(guò)對(duì) mir-24 序列的物種間比對(duì)，，發(fā)現(xiàn)在 3p 區(qū)域其保守性極強(qiáng)，可能具有物種間的保守性調(diào)控肌肉發(fā)育的功能(圖 2-4)。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：S823

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本文編號(hào)：2637884