【摘要】：豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的豬的一種急性、高度接觸性的腸道傳染病,在臨床上主要表現(xiàn)為豬的嘔吐、腹瀉和脫水,其中仔豬死亡率高達(dá)100%,嚴(yán)重威脅國(guó)內(nèi)外養(yǎng)豬業(yè)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展。盡管對(duì)PED的報(bào)道已有四十多年的歷史,但有關(guān)該病的致病機(jī)制卻知之甚少。本研究發(fā)現(xiàn),PEDV感染細(xì)胞后可以引起表皮生長(zhǎng)因子受體(Epidermal Growth Factor Receptor,EGFR)的磷酸化,提示病毒感染可激活EGFR。已有文獻(xiàn)報(bào)道EGFR在某些病毒感染中發(fā)揮重要作用,因此我們對(duì)EGFR在PEDV感染中的作用進(jìn)行了解析。首先,我們運(yùn)用EGFR配體EGF(Epidermal Growth Factor)特異性激活EGFR后測(cè)定其對(duì)PEDV感染的影響,結(jié)果顯示活化的EGFR提高了病毒RNA水平和病毒滴度,表明EGFR可促進(jìn)病毒感染。同時(shí),EGFR過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)證實(shí)當(dāng)EGFR功能增強(qiáng)時(shí),病毒的感染效率增強(qiáng),這提示EGFR參與PEDV感染。我們使用EGFR特異性抑制劑Erlotinib和Gefitinib進(jìn)一步測(cè)定EGFR對(duì)PEDV感染的影響。間接免疫熒光檢測(cè)結(jié)果表明EGFR抑制劑顯著降低PEDV的感染效率,western blot、相對(duì)熒光定量PCR和TCID_(50)結(jié)果證明隨著抑制劑濃度升高,病毒蛋白表達(dá)水平、RNA水平和病毒滴度逐漸降低。此外,我們引入EGFR特異性siRNA,western blot結(jié)果證明EGFR內(nèi)源性表達(dá)被敲低后可以抑制病毒蛋白的合成,相對(duì)熒光定量PCR和TCID_(50)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示EGFR表達(dá)量降低后病毒的RNA水平和滴度顯著降低。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)在PEDV感染中,EGFR發(fā)揮重要作用。因此,我們對(duì)EGFR影響PEDV感染的分子機(jī)制進(jìn)行了探索。首先,使用EGFR特異性的siRNA檢測(cè)其對(duì)IFN-I的影響。相對(duì)熒光定量PCR結(jié)果顯示敲低EGFR后IFN-I相關(guān)基因MxA,ISG15和IFN-β的mRNA水平均明顯升高,表明抑制EGFR活性可以恢復(fù)細(xì)胞抗病毒活性來(lái)抑制PEDV感染。進(jìn)而我們檢測(cè)PEDV感染后EGFR下游分子STAT3的變化情況,western blot結(jié)果表明在PEDV感染中,STAT3也被磷酸化,提示病毒感染激活了EGFR及其下游分子STAT3。運(yùn)用STAT3抑制劑或者STAT3特異性siRNA抑制STAT3活性或表達(dá),相對(duì)熒光定量PCR結(jié)果顯示當(dāng)抑制STAT3功能時(shí),干擾素相關(guān)基因MxA,ISG15和IFN-β的mRNA水平明顯升高,提示抑制STAT3活性可促進(jìn)干擾素產(chǎn)生。相對(duì)熒光定量PCR和western blot檢測(cè)過(guò)表達(dá)STAT3對(duì)PEDV感染的影響,結(jié)果顯示提高STAT3表達(dá)水平提高了PEDV的RNA和蛋白水平,表明STAT3的活化可促進(jìn)PEDV的感染。最后,我們運(yùn)用特異性siRNA敲低STAT3表達(dá)結(jié)合EGF處理激活EGFR的方法檢測(cè)EGFR介導(dǎo)的促進(jìn)病毒感染與STAT3的相關(guān)性。Western blot結(jié)果顯示由EGFR活化引起的PEDV N蛋白增加卻因STAT3的敲低而受到抑制,表明病毒感染誘導(dǎo)的EGFR活化可通過(guò)其下游分子STAT3介導(dǎo)的信號(hào)通路來(lái)拮抗細(xì)胞的抗病毒反應(yīng)。本研究首次證明EGFR在PEDV感染中的作用,闡明了一種新的PEDV逃避機(jī)體抗病毒反應(yīng)的機(jī)制,可能作為PEDV感染的治療靶點(diǎn)。
【圖文】：

圖 1.1 PEDV 基因結(jié)構(gòu)圖(Lee C, 2015)Figure 1.1 Genome structure of PEDV圖 1.2 PEDV 結(jié)構(gòu)模式圖(Lee C, 2015)Figure 1.2 Model of PEDV structure在 PEDV 所編碼的這些蛋白中，S 基因編碼的 S 蛋白為病毒粒子表面的纖突蛋白，被認(rèn)為是最重要的病毒表面抗原，在 PEDV 識(shí)別靶細(xì)胞和在細(xì)胞膜融合的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用(Bosch B

圖 1.2 PEDV 結(jié)構(gòu)模式圖(Lee C, 2015)Figure 1.2 Model of PEDV structure些蛋白中，S 基因編碼的 S 蛋白為病毒粒在 PEDV 識(shí)別靶細(xì)胞和在細(xì)胞膜融合的過(guò) et al., 2008)，這種相互作用能夠刺激宿主機(jī)很強(qiáng)的預(yù)防作用(Chang S H, et al., 2002; G, et al., 2010)。在病毒入侵細(xì)胞時(shí)，，S 蛋白內(nèi)毒力的強(qiáng)弱(Sato T, et al., 2011)。研究發(fā)為 COE 序列。COE 序列中任何一個(gè)氨基白除了可以用來(lái)分析其分子流行病學(xué)外，產(chǎn)中(Chen Q, et al., 2014; Gerber P F, et al.,14)。E 基因編碼的蛋白稱為 E 蛋白，也稱表面，在病毒的自我組裝以及病毒粒子的中，該蛋白的恒定表達(dá)促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生l., 2013)。M 基因編碼的 M 蛋白可以將病揮重要作用，M 蛋白和 E 蛋白相互作用可
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S858.28

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 孟曉宏;;豬流行性腹瀉的診治[J];國(guó)外畜牧學(xué)(豬與禽);2015年10期

2 甘振磊;湯德元;李春燕;王彬;張曉杰;王鳳;劉志杰;;豬流行性腹瀉流行特點(diǎn)及流行現(xiàn)狀的研究[J];豬業(yè)科學(xué);2010年12期

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本文編號(hào)：2637759