【摘要】：肝片吸蟲(chóng)病是由肝片形吸蟲(chóng)(Fasciola hepatica)寄生于牛、羊等反芻動(dòng)物的肝臟和肝膽管內(nèi)而引起的一種吸蟲(chóng)病。本病呈世界性流行,據(jù)統(tǒng)計(jì),全球約有2.5億-3億牛、羊感染片形吸蟲(chóng),每年因片形吸蟲(chóng)感染造成的經(jīng)濟(jì)損失超過(guò)30億美元,特別重要的是,該蟲(chóng)還可感染人,是一種非常重要的人獸共患病病原。因此,肝片吸蟲(chóng)病不僅給畜牧業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失,同時(shí)也給人類(lèi)健康帶來(lái)極大威脅。目前,我國(guó)對(duì)肝片吸蟲(chóng)病的診斷主要以蟲(chóng)卵檢查法和剖檢法為主,但蟲(chóng)卵檢查只能檢測(cè)肝片吸蟲(chóng)感染晚期的動(dòng)物,而肝片吸蟲(chóng)對(duì)動(dòng)物的危害則主要集中在感染早期的移行階段;剖檢法是對(duì)疑似感染的動(dòng)物進(jìn)行剖殺檢查,不適用于活體診斷。近年來(lái)發(fā)展了一些免疫學(xué)診斷方法,如間接血凝、ELISA方法等,但這些方法多處在實(shí)驗(yàn)室研究階段,還沒(méi)有在臨床中大面積應(yīng)用。雖然國(guó)外已有商品化的診斷試劑盒,但其價(jià)格十分昂貴。因此,我們急需建立一種早期、敏感,特異的診斷方法,為其市場(chǎng)化奠定基礎(chǔ)。利用本實(shí)驗(yàn)室前期研究的綿羊肝片吸蟲(chóng)陽(yáng)性血清與肝片吸蟲(chóng)排泄分泌抗原免疫共沉淀產(chǎn)物的質(zhì)譜分析結(jié)果,篩選出5種存在于肝片吸蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育各個(gè)時(shí)期的蛋白,分別為組織蛋白酶L1(Cathepsin L1,CL1)、組織蛋白酶L2(Cathepsin L2,CL2)、熱休克蛋白70(Heat shock protein 70,HSP70)、亮氨酸氨基肽酶(Leucine aminopeptidase,LAP)和天冬氨酰內(nèi)肽酶(Legumain,LEG),其中LEG在肝片吸蟲(chóng)蛋白中的研究還未見(jiàn)報(bào)道。通過(guò)RT-PCR獲得肝片吸蟲(chóng)的cDNA,設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增出5種蛋白的基因片段,目的片段經(jīng)雙酶切后,連接至表達(dá)載體pET-28a(+)中,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài)細(xì)胞中,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后進(jìn)行SDS-PAGE,確定蛋白正確表達(dá)后再Western blot分析蛋白是否具有反應(yīng)原性。對(duì)蛋白的純化方法及條件進(jìn)行優(yōu)化,收集純化后的蛋白并進(jìn)行濃度測(cè)定。蛋白純化后,對(duì)5種蛋白進(jìn)行棋盤(pán)法ELISA檢測(cè),棋盤(pán)法結(jié)果進(jìn)行分析后,根據(jù)P/N值篩選出CL1為最適ELISA診斷蛋白進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。優(yōu)化間接ELISA反應(yīng)條件,包括包被液選擇、包被蛋白濃度、封閉液選擇及封閉時(shí)間摸索、一抗、二抗?jié)舛�、血清中非特異性因素的去除、特異性�?shí)驗(yàn)、敏感性實(shí)驗(yàn)及陰陽(yáng)性臨界值確定等。結(jié)果表明:最佳包被液為碳酸鹽緩沖液(CBS),包被抗原最適濃度為7.5μg/mL,最佳封閉液為5%的脫脂乳,最佳封閉溫度及時(shí)間為37℃2 h,最佳一抗稀釋濃度為1:200,37℃孵育2 h,二抗按照1:10000倍稀釋最佳;建立的間接ELISA診斷方法不與大片吸蟲(chóng)、日本血吸蟲(chóng)等陽(yáng)性血清發(fā)生交叉反應(yīng)。本方法重復(fù)性好,批內(nèi)及批間的變異系數(shù)均低于10%,特異性為97.3%,敏感性為94.0%,最早可以檢出人工感染28天的肝片吸蟲(chóng)綿羊血清。與國(guó)外商品化診斷試劑盒比較其符合率為99.1%。臨床檢測(cè)了黑龍江省及吉林省的綿羊308份血清,陽(yáng)性率為3.9%。本實(shí)驗(yàn)成功地表達(dá)了5種蛋白,篩選出了反應(yīng)原性良好,能適用于肝片吸蟲(chóng)病診斷的蛋白——組織蛋白酶L1,并利用該蛋白作為診斷抗原建立了檢測(cè)肝片吸蟲(chóng)抗體的間接ELISA方法,該方法具有早期、敏感、特異、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)。為肝片吸蟲(chóng)病診斷試劑盒的研究奠定基礎(chǔ)。
【圖文】：

同時(shí)也可感染人[1-3]。本病呈世界性流行并且分布較廣，主要分布于歐洲、非洲、亞洲、美洲等地（見(jiàn)圖1.1）。如南美洲國(guó)家智利[4]1989-1995 年肝片吸蟲(chóng)的感染情況綿羊的感染率為 2.1%，牛的感染率為 30.1%；阿根廷[5]北部地區(qū)的 12-18 個(gè)月齡的綿羊的感染率為 4.8%，5 歲以上的綿羊的感染率則上升為 77%，，可見(jiàn)隨著動(dòng)物年齡的增高感染情況也加重；玻利維亞[6]1992-1994 年間據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)全國(guó)感染肝片吸蟲(chóng)牛為 15.4。北美洲墨西哥北部[7]，經(jīng)過(guò)糞便檢查法檢出的牛肝片吸蟲(chóng)的患病率為 11.4%，ELISA 的檢出率為 14.4%，山羊的糞便檢出率為 24.5%，ELISA 檢出率為 43%

肝片吸蟲(chóng)病診斷抗原的篩選及間接 ELISA 方法的建立早期童蟲(chóng)在穿過(guò)腸壁進(jìn)入腹腔過(guò)程中，不斷破壞組織并以組織為食[30-35]。童蟲(chóng)在肝臟實(shí)質(zhì)中移行時(shí)以肝細(xì)胞為食。此時(shí)期對(duì)肝臟的損傷較大，引起廣泛的損傷性肝炎[36-39]。膽管上皮出現(xiàn)增生現(xiàn)象[40-41]。當(dāng)肝片吸蟲(chóng)大量寄生時(shí)，可導(dǎo)致膽管堵塞，嚴(yán)重會(huì)使動(dòng)物死亡[42-43]。肝片吸蟲(chóng)病會(huì)引起宿主廣泛肝組織損傷及貧血，長(zhǎng)期化學(xué)藥物治療不僅不會(huì)預(yù)防重復(fù)感染，還可能產(chǎn)生耐藥性[44-47]。
【學(xué)位授予單位】：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：S855.9

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