【摘要】：肝片吸蟲病是由肝片形吸蟲(Fasciola hepatica)寄生于牛、羊等反芻動物的肝臟和肝膽管內(nèi)而引起的一種吸蟲病。本病呈世界性流行,據(jù)統(tǒng)計,全球約有2.5億-3億牛、羊感染片形吸蟲,每年因片形吸蟲感染造成的經(jīng)濟(jì)損失超過30億美元,特別重要的是,該蟲還可感染人,是一種非常重要的人獸共患病病原。因此,肝片吸蟲病不僅給畜牧業(yè)生產(chǎn)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失,同時也給人類健康帶來極大威脅。目前,我國對肝片吸蟲病的診斷主要以蟲卵檢查法和剖檢法為主,但蟲卵檢查只能檢測肝片吸蟲感染晚期的動物,而肝片吸蟲對動物的危害則主要集中在感染早期的移行階段;剖檢法是對疑似感染的動物進(jìn)行剖殺檢查,不適用于活體診斷。近年來發(fā)展了一些免疫學(xué)診斷方法,如間接血凝、ELISA方法等,但這些方法多處在實驗室研究階段,還沒有在臨床中大面積應(yīng)用。雖然國外已有商品化的診斷試劑盒,但其價格十分昂貴。因此,我們急需建立一種早期、敏感,特異的診斷方法,為其市場化奠定基礎(chǔ)。利用本實驗室前期研究的綿羊肝片吸蟲陽性血清與肝片吸蟲排泄分泌抗原免疫共沉淀產(chǎn)物的質(zhì)譜分析結(jié)果,篩選出5種存在于肝片吸蟲生長發(fā)育各個時期的蛋白,分別為組織蛋白酶L1(Cathepsin L1,CL1)、組織蛋白酶L2(Cathepsin L2,CL2)、熱休克蛋白70(Heat shock protein 70,HSP70)、亮氨酸氨基肽酶(Leucine aminopeptidase,LAP)和天冬氨酰內(nèi)肽酶(Legumain,LEG),其中LEG在肝片吸蟲蛋白中的研究還未見報道。通過RT-PCR獲得肝片吸蟲的cDNA,設(shè)計特異性引物擴(kuò)增出5種蛋白的基因片段,目的片段經(jīng)雙酶切后,連接至表達(dá)載體pET-28a(+)中,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài)細(xì)胞中,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后進(jìn)行SDS-PAGE,確定蛋白正確表達(dá)后再Western blot分析蛋白是否具有反應(yīng)原性。對蛋白的純化方法及條件進(jìn)行優(yōu)化,收集純化后的蛋白并進(jìn)行濃度測定。蛋白純化后,對5種蛋白進(jìn)行棋盤法ELISA檢測,棋盤法結(jié)果進(jìn)行分析后,根據(jù)P/N值篩選出CL1為最適ELISA診斷蛋白進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化實驗。優(yōu)化間接ELISA反應(yīng)條件,包括包被液選擇、包被蛋白濃度、封閉液選擇及封閉時間摸索、一抗、二抗?jié)舛�、血清中非特異性因素的去除、特異性實驗、敏感性實驗及陰陽性臨界值確定等。結(jié)果表明:最佳包被液為碳酸鹽緩沖液(CBS),包被抗原最適濃度為7.5μg/mL,最佳封閉液為5%的脫脂乳,最佳封閉溫度及時間為37℃2 h,最佳一抗稀釋濃度為1:200,37℃孵育2 h,二抗按照1:10000倍稀釋最佳;建立的間接ELISA診斷方法不與大片吸蟲、日本血吸蟲等陽性血清發(fā)生交叉反應(yīng)。本方法重復(fù)性好,批內(nèi)及批間的變異系數(shù)均低于10%,特異性為97.3%,敏感性為94.0%,最早可以檢出人工感染28天的肝片吸蟲綿羊血清。與國外商品化診斷試劑盒比較其符合率為99.1%。臨床檢測了黑龍江省及吉林省的綿羊308份血清,陽性率為3.9%。本實驗成功地表達(dá)了5種蛋白,篩選出了反應(yīng)原性良好,能適用于肝片吸蟲病診斷的蛋白——組織蛋白酶L1,并利用該蛋白作為診斷抗原建立了檢測肝片吸蟲抗體的間接ELISA方法,該方法具有早期、敏感、特異、價格低廉等優(yōu)點。為肝片吸蟲病診斷試劑盒的研究奠定基礎(chǔ)。
【圖文】：

同時也可感染人[1-3]。本病呈世界性流行并且分布較廣，主要分布于歐洲、非洲、亞洲、美洲等地（見圖1.1）。如南美洲國家智利[4]1989-1995 年肝片吸蟲的感染情況綿羊的感染率為 2.1%，牛的感染率為 30.1%；阿根廷[5]北部地區(qū)的 12-18 個月齡的綿羊的感染率為 4.8%，5 歲以上的綿羊的感染率則上升為 77%，，可見隨著動物年齡的增高感染情況也加重；玻利維亞[6]1992-1994 年間據(jù)不完全統(tǒng)計全國感染肝片吸蟲牛為 15.4。北美洲墨西哥北部[7]，經(jīng)過糞便檢查法檢出的牛肝片吸蟲的患病率為 11.4%，ELISA 的檢出率為 14.4%，山羊的糞便檢出率為 24.5%，ELISA 檢出率為 43%

肝片吸蟲病診斷抗原的篩選及間接 ELISA 方法的建立早期童蟲在穿過腸壁進(jìn)入腹腔過程中，不斷破壞組織并以組織為食[30-35]。童蟲在肝臟實質(zhì)中移行時以肝細(xì)胞為食。此時期對肝臟的損傷較大，引起廣泛的損傷性肝炎[36-39]。膽管上皮出現(xiàn)增生現(xiàn)象[40-41]。當(dāng)肝片吸蟲大量寄生時，可導(dǎo)致膽管堵塞，嚴(yán)重會使動物死亡[42-43]。肝片吸蟲病會引起宿主廣泛肝組織損傷及貧血，長期化學(xué)藥物治療不僅不會預(yù)防重復(fù)感染，還可能產(chǎn)生耐藥性[44-47]。
【學(xué)位授予單位】：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S855.9

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本文編號：2637409