【摘要】：沙門氏菌(Salmonella)為腸桿菌科、沙門氏菌屬成員,是一類革蘭氏陰性腸桿菌,該菌對(duì)我國畜禽養(yǎng)殖業(yè)威脅較大,同時(shí)也可以引起食源性污染從而嚴(yán)重威脅人類健康和食品安全。細(xì)菌s RNA是近些年來發(fā)現(xiàn)的一類細(xì)菌重要生命活動(dòng)調(diào)控因子,其中反式s RNA需要細(xì)菌s RNA伴侶蛋白Hfq協(xié)同調(diào)控毒力基因表達(dá)、壓力應(yīng)答、營養(yǎng)物質(zhì)吸收、適應(yīng)環(huán)境變化及群體感應(yīng)中發(fā)揮重要作用。本研究以鼠傷寒沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)株為模版,構(gòu)建出鼠傷寒沙門氏菌hfq基因缺失株,將鼠傷寒沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)株和鼠傷寒沙門氏菌hfq基因缺失株分別培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期,提取RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,篩選差異表達(dá)基因、進(jìn)行GO富集分析和Pathway富集分析,并篩選部分差異表達(dá)基因進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證,篩選相關(guān)通路進(jìn)行深入分析,篩選沙門氏菌hfq基因缺失株重要調(diào)控基因。1.鼠傷寒沙門氏菌hfq基因缺失株的構(gòu)建及鑒定采用P22噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù),以鼠傷寒沙門氏菌yifk::Mud K△hfq::cat基因缺失株為供體菌,鼠傷寒沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)株為受體菌,構(gòu)建鼠傷寒沙門氏菌hfq基因缺失株,PCR擴(kuò)增及基因測(cè)序結(jié)果表明鼠傷寒沙門氏菌hfq基因缺失株構(gòu)建成功。2.鼠傷寒沙門氏菌hfq基因缺失株的轉(zhuǎn)錄組分析對(duì)鼠傷寒沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)株和鼠傷寒沙門氏菌hfq基因缺失株的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果采用DEseq2的算法,在對(duì)數(shù)期篩選出差異表達(dá)基因1055個(gè),其中表達(dá)顯著上調(diào)基因516個(gè),表達(dá)顯著下調(diào)基因539個(gè),在穩(wěn)定期篩選出差異表達(dá)基因959個(gè),其中表達(dá)顯著上調(diào)基因496個(gè),表達(dá)顯著下調(diào)基因463個(gè)。對(duì)隨機(jī)篩選的STM3630,STM2890,STM2874,STM3764,STM4361,STM2898,STM2640,STM2893,STM1583,STM2897和STM1091等11個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證,趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序相符,表明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果可靠。將鼠傷寒沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)株和鼠傷寒沙門氏菌hfq基因缺失株的差異表達(dá)基因在GO數(shù)據(jù)庫和KEGG數(shù)據(jù)庫中注釋,對(duì)數(shù)期顯著差異表達(dá)基因主要富集在鈷胺素代謝過程、鈷胺素生物合成過程、碳水化合物代謝過程等生物過程中,以及細(xì)菌趨化性、丙酸代謝、碳代謝、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、不同環(huán)境中的微生物代謝、卟啉與葉綠素代謝、光合生物固碳、戊糖磷酸途徑、原核生物中的固碳途徑、檸檬酸循環(huán)和糖酵解途徑等11個(gè)信號(hào)通路中。穩(wěn)定期顯著差異表達(dá)基因主要富集在鈷胺素代謝過程、鈷胺素生物合成過程、胞質(zhì)過程、核糖體RNA結(jié)合過程等生物學(xué)過程,卟啉和葉綠素代謝等信號(hào)通路中。3.基于轉(zhuǎn)錄組結(jié)果分析的鼠傷寒沙門氏菌hfq基因缺失株重要差異共表達(dá)基因篩選在鼠傷寒沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)株和鼠傷寒沙門氏菌hfq基因缺失株轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的基礎(chǔ)上,篩選致病機(jī)制生物學(xué)過程,趨化性通路、分泌通路、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通路、雙組分通路和群體感應(yīng)通路等信號(hào)通路的富集基因。在對(duì)數(shù)期對(duì)致病機(jī)制生物學(xué)過程,趨化性通路、分泌通路、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通路、雙組分通路和群體感應(yīng)通路等信號(hào)通路進(jìn)行篩選差異表達(dá)基因篩選,分別篩選出27、12、11、66、68和18個(gè)基因。在穩(wěn)定期對(duì)致病機(jī)制生物學(xué)過程,趨化性、分泌、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、雙組分系統(tǒng)和群體感應(yīng)等信號(hào)通路進(jìn)行篩選差異表達(dá)基因篩選,分別篩選出36、6、15、49、56和18個(gè)基因。篩選對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期生物學(xué)過程及信號(hào)通路差異共表達(dá)基因,在致病機(jī)制生物學(xué)過程及趨化性通路、分泌通路、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通路、雙組分通路和群體感應(yīng)等信號(hào)通路中分別篩選到14、4、7、20、16和5個(gè)基因,在以上生物學(xué)過程及信號(hào)通路中參與兩個(gè)及以上的重要差異共表達(dá)基因有8個(gè),分別為hilA、spaS、invG、spaP、invA、pstS、STM1678、mppA,提示可能為鼠傷寒沙門氏菌sRNA伴侶蛋白Hfq的調(diào)控靶基因。綜上所述,采用P22噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)成功構(gòu)建鼠傷寒沙門氏菌hfq基因缺失株,將鼠傷寒沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)株和鼠傷寒沙門氏菌hfq基因缺失株分別培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,篩選差異表達(dá)基因,進(jìn)行GO富集分析和Pathway富集分析,篩選對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期相關(guān)功能生物學(xué)過程和信號(hào)通路差異共表達(dá)基因,尋找到hfq可能靶基因8個(gè)。
【圖文】：

2016；Vogel et al.，，2009）。細(xì)菌中約 98%調(diào)控因子，它可以激活或者抑制靶點(diǎn)，正向或點(diǎn)，大量細(xì)菌 sRNA 及其伴侶蛋白 Hfq 的調(diào)善�，F(xiàn)，大腸桿菌 6S RNA 被發(fā)現(xiàn)為細(xì)菌中首個(gè)非AMicF 抑制 OmpF mRNA 的轉(zhuǎn)錄（Mizuno 隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)步，一些新的檢測(cè)技域，隨后在大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡了 sRNA，并且大腸桿菌 sRNA 因?yàn)榕c其他細(xì)知，截至目前在 sRNAMap 數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)的過 80 種，沙門氏菌 sRNA 超過 30 種。

圖 2 順式編碼的小 RNA 的調(diào)節(jié)作用Fig. 2 Regulation of cis-encoded small RNA碼的 sRNA 是細(xì)菌 sRNA 發(fā)揮調(diào)節(jié)功能最為普遍的一種形式，目前大多數(shù)都屬于這個(gè)類型。它通常作用于遠(yuǎn)處的一或多個(gè)靶點(diǎn)，同靶么抑制或促進(jìn)靶 mRNA 的轉(zhuǎn)譯，要么加速或減緩靶 mRNA 的降解（RprA 等 sRNA 通過與 mRNA 本是發(fā)夾結(jié)構(gòu)的 5’非翻譯區(qū)結(jié)合，’非翻譯區(qū)結(jié)合的核糖體結(jié)合位點(diǎn)，從而使之與核糖體結(jié)合，促進(jìn) 等 sRNA 則是發(fā)揮抑制作用，與靠近靶標(biāo) mRNA 核糖體結(jié)合位點(diǎn)基配對(duì)，導(dǎo)致核糖體無法與之結(jié)合、抑制翻譯起始，另外細(xì)菌核糖作用 sRNA-Hfq-mRNA 復(fù)合體從而降解靶 mRNA 和 sRNA。它們 伴侶 Hfq 結(jié)合發(fā)揮作用（Hoe et al.，2013）。 所示，順式編碼 sRNA 和反式編碼 sRNA 的區(qū)別在于順式編碼的 sR因重疊，它們有一個(gè)完美的配對(duì)區(qū)，而反式編碼的 sRNA 基因通常
【學(xué)位授予單位】：貴州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S852.61

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9 朱森林;陳e

本文編號(hào)：2636713