【摘要】：豬骨骼肌衛(wèi)星細胞在豬的肌肉發(fā)育及再生過程中起到極為重要的作用。在豬肌肉生成過程中,骨骼肌衛(wèi)星細胞作為肌肉干細胞,通過激活、增殖分化形成肌管參與肌肉的發(fā)育和修復過程。已有研究表明,成肌過程中衛(wèi)星細胞的增殖和分化受信號通路、轉(zhuǎn)錄因子及表觀修飾等一系列因素的調(diào)控。其中,表觀修飾通過改變組蛋白和轉(zhuǎn)錄因子的共價修飾及相應的染色質(zhì)構(gòu)象,激活成肌特異基因的表達,調(diào)控成肌祖細胞命運及衛(wèi)星細胞不同狀態(tài)之間的準確轉(zhuǎn)換。目前對豬骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖和分化過程的表觀遺傳機制研究仍較少。因此,本研究使用新生仔豬進行原代骨骼肌衛(wèi)星細胞分離及培養(yǎng)研究。結(jié)合RNA-Seq和ChIP-Seq技術對增殖和分化的豬骨骼肌衛(wèi)星細胞基因轉(zhuǎn)錄及三種組蛋白(H3K4me3、H3K27ac和H3K27me3)和RNA聚合酶II(RNA polymorse II,RNAPII)的修飾模式進行綜合分析,解析豬骨骼肌衛(wèi)星細胞分化過程中組蛋白修飾調(diào)控基因差異表達的分子機制。主要取得了如下結(jié)果:(1)建立并優(yōu)化豬骨骼肌衛(wèi)星細胞原代分離及培養(yǎng)方法。本研究建立并比較兩種骨骼肌衛(wèi)星細胞分離方法,發(fā)現(xiàn)組織塊消化法分離豬骨骼肌衛(wèi)星細胞實驗周期短,所獲得細胞量大。且原代分離的豬骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖速度快,具有較強的肌源干細胞特性,誘導分化兩天即可觀察到大量明顯的肌管形成。在培養(yǎng)基中添加白血病抑制因子、GSK3β和MEK1/2抑制物能夠有效維持骨骼肌衛(wèi)星細胞的干細胞特性,上調(diào)衛(wèi)星細胞中PAX7的表達量。(2)鑒定了原代豬骨骼肌衛(wèi)星細胞純度、傳代能力以及轉(zhuǎn)染效率。研究表明,傳代后的豬骨骼肌衛(wèi)星細胞依然能夠快速增殖,具有較強的肌源性分化能力。且轉(zhuǎn)染后的GFP陽性衛(wèi)星細胞統(tǒng)計結(jié)果表明,豬骨骼肌衛(wèi)星細胞轉(zhuǎn)染效率約為46%。此外,通過免疫熒光實驗發(fā)現(xiàn)PAX7陽性的衛(wèi)星細胞純度約為93%,能夠用于后期相關實驗研究。(3)鑒定了成肌相關marker基因在豬骨骼肌衛(wèi)星細胞分化過程中的表達模式。免疫熒光結(jié)果表明,PAX7和MYOD1均在增殖期衛(wèi)星細胞中高表達,而MYOG和MYOSIN僅能夠在分化的肌管中檢測到。(4)深度挖掘并分析了豬骨骼肌衛(wèi)星細胞基因表達圖譜,構(gòu)建了衛(wèi)星細胞基因調(diào)控網(wǎng)絡。轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)骨骼肌衛(wèi)星細胞分化過程中有917個差異表達基因,其中上調(diào)表達基因511個,下調(diào)表達基因406個,主要富集在肌肉發(fā)育和細胞周期相關的生物學過程中,也發(fā)現(xiàn)部分組蛋白生成及染色質(zhì)重塑相關的基因在細胞分化過程中差異表達。同時,5個上調(diào)表達基因和9個下調(diào)表達基因的qPCR結(jié)果表明衛(wèi)星細胞中的基因表達差異與高通量測序數(shù)據(jù)分析結(jié)果相一致。(5)鑒定了三種組蛋白修飾(H3K4me3、H3K27ac和H3K27me3)和轉(zhuǎn)錄因子RNAPII在全基因組范圍內(nèi)的表觀修飾模式,并檢測到組蛋白修飾在衛(wèi)星細胞分化過程中修飾程度顯著下調(diào),其中H3K27me3組蛋白修飾程度降低約50%,組蛋白結(jié)合峰從22060減少至11573個。且RNAPII修飾水平在轉(zhuǎn)錄起始位點和基因區(qū)劇烈下降,減少了3958個信號結(jié)合峰,進一步調(diào)節(jié)基因表達模式,促進豬骨骼肌衛(wèi)星細胞肌源性分化。(6)繪制了基因轉(zhuǎn)錄和表觀修飾模式圖譜,并分析基因表達與三種組蛋白修飾及RNAPII之間的聯(lián)系。H3K4me3和H3K27ac組蛋白修飾以及轉(zhuǎn)錄因子RNAPII主要標記活性基因的轉(zhuǎn)錄起始位點。而H3K27me3修飾則主要富集在染色質(zhì)抑制區(qū)域,調(diào)節(jié)179個基因的轉(zhuǎn)錄表達。(7)解釋了組蛋白修飾變化對基因差異表達的調(diào)控機制,表明在豬骨骼肌衛(wèi)星細胞分化過程中,基因的上調(diào)表達伴隨著明顯的RNAPII和H3K27ac組蛋白修飾程度上升及H3K27me3組蛋白修飾降低。且H3K27me3組蛋白修飾與骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖相關基因的沉默密切相關。同時,H3K27me3修飾水平的降低促進139個成肌特異基因的上調(diào)表達,調(diào)控豬骨骼肌衛(wèi)星細胞的成肌分化。綜上所述,在豬骨骼肌衛(wèi)星細胞分化過程中,成肌特異轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄起始位點的H3K27me3組蛋白修飾程度下降,上調(diào)包括MYOG和MEF2C等基因的表達,進一步激活下游基因轉(zhuǎn)錄,促進衛(wèi)星細胞分化及肌管形成。本研究結(jié)合轉(zhuǎn)錄組和組蛋白修飾模式分析豬骨骼肌衛(wèi)星細胞成肌分化的分子機制,為闡明組蛋白修飾調(diào)控衛(wèi)星細胞分化的表觀遺傳機制提供了新的線索。
【圖文】：

華中農(nóng)業(yè)大學 2019 屆博士研究生學位（畢業(yè)）論文骨骼肌的發(fā)育是一個復雜且有序的過程。在脊椎動物中，，骨骼肌的胚胎發(fā)育模式相似，除了一些顱面和食道肌，大部分肌肉均發(fā)育自中胚層（mesoderm）細胞。在胚胎發(fā)育的早期階段，軸旁中胚層（paraxial mesoderm）的細胞受脊索和神經(jīng)管的信號調(diào)節(jié)，以頭至尾側(cè)的方向分化形成暫時性的體節(jié)組織（somite）（Pourquie 2001,Pownall et al. 2002）。隨后體節(jié)沿背腹軸方向分層形成背側(cè)生皮肌節(jié)和腹側(cè)生骨節(jié)。其中，背側(cè)的生皮肌節(jié)進一步分化形成軀干和肢體骨骼肌組織，在成肌相關基因的調(diào)控下遷移至肢體相應部位形成成肌細胞，并進一步發(fā)育成骨骼肌組織（圖 1）（Stockdale et al. 2000, Summerbell and Rigby 2000）。De Angelis 等人的相關研究表明，小鼠的骨骼肌干細胞出現(xiàn)在胚胎發(fā)育晚期，并且在出生后的肌肉生長期間高度活躍，為成年個體提供肌肉干細胞來源（DeAngelis et al. 1999）。

圖 2. 骨骼肌結(jié)構(gòu)示意圖（Relaix and Zammit 2012）Figure 2. The structure of skeletal muscle.3.1 骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖發(fā)育研究進展近年來，骨骼肌衛(wèi)星細胞的激活及增殖過程一直是研究熱點。Pax3 和 Pax7為是衛(wèi)星細胞命運決定的主要調(diào)控因子。其中 Pax7 在成年個體的衛(wèi)星細胞中高達，而 Pax3 僅在膈肌等肌肉組織的衛(wèi)星細胞中高表達，在其他肌肉中表達水平（Soleimani et al. 2012b）。Pax3 和 Pax7 作為成肌過程的兩個上游轉(zhuǎn)錄因子，能過調(diào)控生肌調(diào)控因子（myogenic regulate factors, MRFs）的時空表達調(diào)節(jié)肌肉發(fā)程。Pax3 主要在肌肉的胚胎發(fā)育過程發(fā)揮作用，并通過結(jié)合 Myf5 的遠程增強進干細胞激活轉(zhuǎn)換為成肌細胞。Pax7 則在個體出生后的肌肉發(fā)育過程中起作用通過激活 MyoD 的表達促進細胞進入增殖狀態(tài)（Olguin and Olwin 2004, Zammil. 2004）。研究表明敲除 Pax7 基因并不影響 Myf5 的基因轉(zhuǎn)錄，但會導致 MyoD
【學位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S828

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本文編號：2637039