發(fā)布時間：2020-04-21 18:26

【摘要】：溶瘤病毒是一類具有復制能力的腫瘤殺傷型病毒;能特異性識別并感染腫瘤細胞;最終導致細胞溶脹而摧毀腫瘤細胞;但無法在正常機體細胞內(nèi)復制而不具有殺傷作用;理論上具有更高的抗腫瘤效應(yīng)和更低的副作用。新城疫病毒作為一種新型的病毒載體可以通過表達外源基因來發(fā)揮抗腫瘤作用,如通過表達促凋亡蛋白增加腫瘤細胞的凋亡水平、通過抑制先天性免疫反應(yīng)和增加融合能力來增加病毒復制能力和細胞間傳遞能力、通過表達腫瘤相關(guān)性抗原來激活腫瘤特異性淋巴細胞、通過表達抗腫瘤抗體來激活抗體依賴性細胞調(diào)控的細胞毒性反應(yīng)、通過表達細胞因子來激活和招募淋巴細胞和樹突狀細胞等。研究發(fā)現(xiàn),利用重組新城疫病毒載體(rNDV)同時表達兩種外源基因可以共同調(diào)控病毒的溶瘤活性,并且溶瘤活性優(yōu)于單獨表達單個外源基因的效果,此外,外源基因的插入位點影響外源蛋白的表達水平,進而影響重組病毒的抗腫瘤活性。然而,rNDV表達兩種外源基因時外源基因插入位點的最佳組合方式尚不清楚。本研究采用rClone30弱毒株為病毒骨架構(gòu)建了表達單熒光蛋白基因的重組病毒質(zhì)粒和表達雙熒光蛋白基因的重組病毒質(zhì)粒,通過反向遺傳學操作技術(shù)平臺,拯救了具有感染性的表達單熒光蛋白的重組病毒和表達雙熒光蛋白的重組病毒,重組病毒經(jīng)鑒定和性質(zhì)測定后轉(zhuǎn)染四種腫瘤細胞,采用免疫熒光實驗和流式細胞術(shù)檢測熒光蛋白的表達水平,通過熒光強度的差異判定外源基因的表達水平,同時探討rNDV表達兩種外源基因時的外源基因插入位點的最佳組合方式。實驗結(jié)果如下:根據(jù)新城疫病毒基因組中位點選擇的差異,采用rClone30弱毒株為病毒骨架,通過病毒圖譜選擇合適的酶切位點,構(gòu)建了在NP/P位點和/或P/M位點插入外源熒光蛋白基因EGFP或RFP的重組病毒質(zhì)粒;采用脂質(zhì)體3000轉(zhuǎn)染試劑摸索轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒的比例,通過反向遺傳學操作技術(shù)平臺,拯救了具有感染性的表達可EGFP和/或RFP的重組病毒;通過提取重組病毒的RNA,采用RT-PCR實驗,證實了重組病毒中外源基因的穩(wěn)定存在;獲得的表達單外源基因的重組新城疫病毒包括rClone30-EGFP(NP/P)、rClone30-EGFP(P/M)和rClone30-RFP(P/M),表達雙外源基因的重組新城疫病毒包括rClone30-EGFP(NP/P)-RFP(P/M)和rClone30-RFP-EGFP(P/M)。通過重組病毒凝集雞紅細胞、感染雞成纖維細胞、感染SPF雞胚和感染雛雞,采用HA、TCID_(50)、EID_(50)、MDT和ICPI實驗證實拯救的重組病毒在病毒滴度,病毒毒力和病毒致病力等指標上仍為弱毒株;通過繪制并比較重組病毒與親本病毒的生長曲線證實重組病毒與親本病毒具有相似的生長動力學;結(jié)果表明,所構(gòu)建的5種重組新城疫病毒在生長動力學和分子生物學特性上與親本病毒無顯著差異。體外培養(yǎng)了四種腫瘤細胞HepG2、A549、Hela和U251,將5種重組新城疫病毒分別轉(zhuǎn)染上述四種腫瘤細胞,通過免疫熒光實驗和流式細胞術(shù)實驗檢測重組病毒中外源蛋白EGFP蛋白和/或RFP蛋白的表達水平,通過熒光蛋白熒光強度的差異證實在轉(zhuǎn)染的四種腫瘤細胞中重組病毒rClone30-EGFP(NP/P)-RFP(P/M)和rClone30-RFP-EGFP(P/M)中熒光蛋白的表達水平均顯著高于rClone30-EGFP(NP/P)、rClone30-EGFP(P/M)和rClone30-RFP(P/M)中的表達水平,而重組病毒rClone30-EGFP(NP/P)-RFP(P/M)中外源熒光蛋白的表達水平高于rClone30-RFP-EGFP(P/M)中的表達;同時發(fā)現(xiàn),所構(gòu)建的5種重組病毒在肝癌細胞HepG2中外源基因的表達水平均高于相似其他三種細胞(A549、Hela和U251)中的表達水平。結(jié)果表明,在外源基因的表達水平上表達雙基因的重組病毒優(yōu)于表達單基因的重組病毒,在外源基因的插入位點上兩種外源基因分別插入在NP/P位點和P/M位點時外源蛋白的表達水平最高。如上所述,本研究成功構(gòu)建并拯救了表達單外源基因和表達雙外源基因的重組新城疫病毒;重組新城疫病毒與親本病毒相比具有相似的生長動力學和生物學特性;確定了rNDV表達兩種外源基因時外源基因的最佳插入位點為NP/P位點插入EGFP同時P/M位點插入RFP。本研究為進一步通過有效表達多種外源基因從而增強重組新城疫病毒的抗腫瘤活性研究奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

圖 1-1 新城疫病毒的基因組結(jié)構(gòu)[4]Fig.1-1 Genome organization of Newcastle disease virus[4]NDV 基因組編碼六種結(jié)構(gòu)蛋白，即核衣殼蛋白（Nucleocapsid protein，NP）、磷酸化蛋白（Phosphate protein，P）、基質(zhì)蛋白（Matrix Protein，M）、血凝素神經(jīng)氨酸酶蛋白（Haemagglutinin Neuraminidase protein，HN）、融合蛋白（Fusion protein，F(xiàn)）和依賴性RNA 聚合酶（Large protein，L），，此外，通過 RNA 編輯機制，P 基因可以編碼非結(jié)構(gòu)蛋白V 和 W[5]，如圖 1-2 所示。根據(jù)分布位置不同，新城疫病毒表達的蛋白分為兩類，一類為內(nèi)部蛋白，包括 NP、P 和 L 蛋白，NDV 基因組與這三種蛋白結(jié)合形成核糖核蛋白復合體包裹于病毒囊膜內(nèi)，參與病毒 RNA 的轉(zhuǎn)錄和復制；另一類為外部蛋白，包括 M、F 和 HN蛋白，這兩種糖基化蛋白 F 和 HN 錨定在病毒囊膜表面上形成大、小纖突，是病毒重要的免疫原成分，參與病毒與受體細胞的吸附和融合作用，而基質(zhì)蛋白 M 位于病毒囊膜和核衣殼之間，保證病毒結(jié)構(gòu)的完整性[6]。單股負鏈不分節(jié)段的 RNA 病毒在轉(zhuǎn)錄時下游區(qū)域的基[7]

圖 1-2 新城疫病毒的結(jié)構(gòu)蛋白[4]Fig.1-2 The structural protein of Newcastle disease virus[4]新城疫病毒的溶瘤機制新城疫病毒選擇性的感染腫瘤細胞，且在腫瘤細胞中復制，并有效地裂解腫瘤細正常細胞沒有毒性[8]。病毒的 HN 蛋白可以識別腫瘤細胞表面的受體（唾液酸糖脂）吸附到宿主細胞表面，進一步使 F 蛋白的構(gòu)象發(fā)生變化，促使病毒與細胞膜用[9]。由于在腫瘤細胞中抗病毒信號通路、I 型干擾素信號通路和凋亡信號通路的 Ras 信號的激活和 Rac1 蛋白的表達，使病毒可以在腫瘤細胞中大量復制[10]。作生物制劑的 NDV 可以分為溶瘤株和非溶瘤株，NDV 溶瘤株在腫瘤細胞中復制腫瘤細胞本身的轉(zhuǎn)錄和翻譯機制，使腫瘤細胞表達受阻，代謝紊亂；還可以導致胞之間發(fā)生融合，產(chǎn)生不能存活的合胞體，引起腫瘤細胞的快速、大量死亡；而瘤株產(chǎn)生的新生病毒顆粒包含的 F 蛋白是無活性的形式，在腫瘤細胞中只進行單
【學位授予單位】：黑龍江八一農(nóng)墾大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S852.65

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本文編號：2635563