【摘要】：肉用動物脂肪組織的分布和甘油三酯沉積是影響肉質風味和胴體品質的重要因素。脂肪形成受多種因素影響,其中葡萄糖和維生素D是調(diào)控脂肪形成的2種重要營養(yǎng)物質。葡萄糖是豬脂肪合成的主要前體物質,也通過其代謝中間產(chǎn)物促進轉錄因子碳水化合物反應元件結合蛋白(carbohydrate response element binding protein,ChREBP)表達和誘導其反式激活活性,促進脂肪形成;維生素D在脂肪組織儲存及代謝,對脂肪形成產(chǎn)生明顯影響。硫氧還蛋白互作蛋白(thioredoxin interacting protein,Txnip)作為氧化還原調(diào)節(jié)蛋白質,通過與硫氧還蛋白結合并抑制其活性,調(diào)節(jié)細胞氧化還原狀態(tài),影響葡萄糖和脂質穩(wěn)態(tài)及脂肪形成等多種細胞生理過程。然而,在葡萄糖和維生素D調(diào)控豬脂肪細胞分化過程中Txnip的作用尚不清楚。因此,本文通過構建靶向豬Txnip基因的siRNA和過表達慢病毒表達載體,轉染原代培養(yǎng)豬皮下前體脂肪細胞,分別用葡萄糖和1,25(OH)_2VD_3處理,研究葡萄糖和1,25(OH)_2VD_3對豬脂肪細胞分化的影響及Txnip的作用,為闡明豬脂肪形成的營養(yǎng)機制提供理論依據(jù)。1.Txnip siRNA表達載體和過表達載體構建構建了3對靶向豬Txnip基因的慢病毒表達質粒Txnip-shRNA,轉染豬前體脂肪細胞后,轉染率達90%以上,其中1對(Txnip-shRNA-2)Txnip沉默率達75%(P0.01);構建了豬Txnip過表達慢病毒表達質粒LV5-Txnip,轉染豬前體脂肪細胞后,轉染率達90%,Txnip表達顯著提高(P0.01)。2.1,25(OH)_2VD_3對豬前體脂肪細胞增殖分化的影響以1×10~(-10)~1×10~-77 mol/L濃度1,25(OH)2VD3處理豬前體脂肪細胞,分別用MTT法和油紅O染色提取法檢測細胞增殖和分化。結果顯示,與未處理的對照組相比,1,25(OH)_2VD_3濃度為1×10~-99 mol/L和1×10~-1010 mol/L時,促進豬前體脂肪細胞的增殖,抑制其分化(P0.05);濃度為1×10~-88 mol/L和1×10~-77 mol/L時,抑制豬前體脂肪細胞增殖,促進分化(P0.01);而當1,25(OH)_2VD_3濃度達1×10~(-6)mol/L時,細胞大量漂浮死亡或凋亡。3.Txnip對豬前體脂肪細胞分化的影響分別以Txnip-shRNA和Txnip過表達慢病毒轉染豬前體脂肪細胞,分別用油紅O染色提取法和實時熒光PCR檢測細胞分化及成脂分化關鍵基因PPARγ、標志基因FAS mRNA表達。Txnip表達沉默后,豬前體脂肪細胞分化、PPARγ和FAS mRNA表達均顯著提高(P0.05),而過表達Txnip細胞的分化、PPARγ和FAS mRNA表達顯著降低(P0.05),說明Txnip可通過下調(diào)PPARγ表達抑制豬前體脂肪細胞分化。4.Txnip在1,25(OH)_2VD_3抑制豬前體脂肪細胞分化中的作用以低濃度1,25(OH)_2VD_3(1×10~-1010 mol/L)處理轉染Txnip-shRNA慢病毒表達質粒和未轉染的豬前體脂肪細胞,檢測細胞分化及成脂基因表達。1,25(OH)_2VD_3處理未轉染的對照細胞,細胞分化及FAS、PPARγ和ERK1/2 mRNA表達顯著降低(P(27)0.05),而Txnip表達水平顯著提高(P(27)0.01)。與未轉染細胞相比,Txnip表達沉默顯著促進了細胞分化、提高了ChREBP、FAS、PPARγ和ERK1/2表達(P(27)0.01),以1,25(OH)_2VD_3處理后,ChREBP mRNA表達沒有顯著變化,但FAS、PPARγ及ERK1/2表達顯著降低(P(27)0.01)。5.葡萄糖誘導豬脂肪細胞分化中Txnip的作用15 mmol/L的高濃度葡萄糖顯著促進豬前體脂肪細胞分化(P0.05);無糖條件下,Txnip表達沉默或Txnip過表達對細胞分化沒有顯著影響;以葡萄糖處理Txnip表達沉默細胞,細胞分化水平顯著提高(P0.05),并顯著高于高糖處理的非轉染對照組細胞(P0.05);葡萄糖處理后,Txnip過表達細胞的分化顯著低于未轉染細胞(P0.05),即Txnip過表達減弱了葡萄糖對脂肪細胞分化的促進作用。綜上所述,低濃度1,25(OH)_2D_3促進豬前體脂肪細胞增殖、抑制分化,高濃度1,25(OH)_2D_3抑制增殖而促進分化,維生素D對豬前體脂肪細胞增殖和分化具有明顯的雙向作用。Txnip通過下調(diào)PPARγ表達,抑制豬前體脂肪細胞分化,但其作用依賴于葡萄糖的存在;低濃度1,25(OH)_2VD_3可能通過誘導Txnip表達從而下調(diào)PPARγ抑制豬前體脂肪細胞分化。葡萄糖促進豬前體脂肪細胞分化,而Txnip減弱葡萄糖對脂肪細胞分化的這種促進作用。
【圖文】：

圖 1-1 豬前體脂肪細胞形態(tài)學觀察A：細胞培養(yǎng) 4 h；B：細胞培養(yǎng) 1 d；C：細胞培養(yǎng) 2 d；D：細胞培養(yǎng) 4 d；E：細胞培養(yǎng) 7 d；F：豬脂肪細胞 Bodipy 染色（7 d）；標尺為 200 μmFig.1-1 The morphological analyses of porcine preadipocyte cellsA: Porcine preadipocyte cells cultured for 4 h; B: Porcine preadipocyte cells cultured for 1d ; C:Porcine preadipocyte cells cultured for 2 d; D: Porcine preadipocyte cells cultured for 4 d; E:Porcine preadipocyte cells cultured for 7 d; F: Bodipy staining of porcine preadipocyte cellscultured for 7 d. Scale bar is 200 μm

誘導分化后培養(yǎng)4d的豬前體脂肪細胞A-F依次是以終濃度為對照組、1×10-10、1×10-9、1×10-8、1×10-7和1×10-6mol/L的1,25(OH)
【學位授予單位】：西北民族大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S828

【參考文獻】

相關期刊論文 前3條

1 張國華;盧建雄;楊具田;臧榮鑫;申曉蓉;趙永清;霍生東;陳妍;;葡萄糖和含腺苷分子通過碳水化合物反應元件結合蛋白(ChREBP)誘導豬脂肪細胞硫氧還蛋白互作蛋白(Txnip)的表達[J];農(nóng)業(yè)生物技術學報;2014年03期

2 盧建雄;張國華;李昌輝;陳妍;霍生東;郭鵬輝;蔡勇;;ChREBP基因siRNA表達質粒構建及對原代培養(yǎng)豬脂肪細胞生脂的影響[J];中國農(nóng)業(yè)科學;2013年24期

3 盧建雄;楊具田;臧榮鑫;申曉蓉;馬省強;;胰島素對原代培養(yǎng)大鼠前體脂肪細胞增殖分化的影響[J];中國獸醫(yī)科學;2006年11期

相關碩士學位論文 前1條

1 李昌輝;豬脂肪細胞體外培養(yǎng)及葡萄糖和胰島素誘導生脂研究[D];西北民族大學;2012年

，

本文編號：2634782