【摘要】：肉用動物脂肪組織的分布和甘油三酯沉積是影響肉質(zhì)風(fēng)味和胴體品質(zhì)的重要因素。脂肪形成受多種因素影響,其中葡萄糖和維生素D是調(diào)控脂肪形成的2種重要營養(yǎng)物質(zhì)。葡萄糖是豬脂肪合成的主要前體物質(zhì),也通過其代謝中間產(chǎn)物促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子碳水化合物反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(carbohydrate response element binding protein,ChREBP)表達(dá)和誘導(dǎo)其反式激活活性,促進(jìn)脂肪形成;維生素D在脂肪組織儲存及代謝,對脂肪形成產(chǎn)生明顯影響。硫氧還蛋白互作蛋白(thioredoxin interacting protein,Txnip)作為氧化還原調(diào)節(jié)蛋白質(zhì),通過與硫氧還蛋白結(jié)合并抑制其活性,調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原狀態(tài),影響葡萄糖和脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)及脂肪形成等多種細(xì)胞生理過程。然而,在葡萄糖和維生素D調(diào)控豬脂肪細(xì)胞分化過程中Txnip的作用尚不清楚。因此,本文通過構(gòu)建靶向豬Txnip基因的siRNA和過表達(dá)慢病毒表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)豬皮下前體脂肪細(xì)胞,分別用葡萄糖和1,25(OH)_2VD_3處理,研究葡萄糖和1,25(OH)_2VD_3對豬脂肪細(xì)胞分化的影響及Txnip的作用,為闡明豬脂肪形成的營養(yǎng)機(jī)制提供理論依據(jù)。1.Txnip siRNA表達(dá)載體和過表達(dá)載體構(gòu)建構(gòu)建了3對靶向豬Txnip基因的慢病毒表達(dá)質(zhì)粒Txnip-shRNA,轉(zhuǎn)染豬前體脂肪細(xì)胞后,轉(zhuǎn)染率達(dá)90%以上,其中1對(Txnip-shRNA-2)Txnip沉默率達(dá)75%(P0.01);構(gòu)建了豬Txnip過表達(dá)慢病毒表達(dá)質(zhì)粒LV5-Txnip,轉(zhuǎn)染豬前體脂肪細(xì)胞后,轉(zhuǎn)染率達(dá)90%,Txnip表達(dá)顯著提高(P0.01)。2.1,25(OH)_2VD_3對豬前體脂肪細(xì)胞增殖分化的影響以1×10~(-10)~1×10~-77 mol/L濃度1,25(OH)2VD3處理豬前體脂肪細(xì)胞,分別用MTT法和油紅O染色提取法檢測細(xì)胞增殖和分化。結(jié)果顯示,與未處理的對照組相比,1,25(OH)_2VD_3濃度為1×10~-99 mol/L和1×10~-1010 mol/L時,促進(jìn)豬前體脂肪細(xì)胞的增殖,抑制其分化(P0.05);濃度為1×10~-88 mol/L和1×10~-77 mol/L時,抑制豬前體脂肪細(xì)胞增殖,促進(jìn)分化(P0.01);而當(dāng)1,25(OH)_2VD_3濃度達(dá)1×10~(-6)mol/L時,細(xì)胞大量漂浮死亡或凋亡。3.Txnip對豬前體脂肪細(xì)胞分化的影響分別以Txnip-shRNA和Txnip過表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染豬前體脂肪細(xì)胞,分別用油紅O染色提取法和實(shí)時熒光PCR檢測細(xì)胞分化及成脂分化關(guān)鍵基因PPARγ、標(biāo)志基因FAS mRNA表達(dá)。Txnip表達(dá)沉默后,豬前體脂肪細(xì)胞分化、PPARγ和FAS mRNA表達(dá)均顯著提高(P0.05),而過表達(dá)Txnip細(xì)胞的分化、PPARγ和FAS mRNA表達(dá)顯著降低(P0.05),說明Txnip可通過下調(diào)PPARγ表達(dá)抑制豬前體脂肪細(xì)胞分化。4.Txnip在1,25(OH)_2VD_3抑制豬前體脂肪細(xì)胞分化中的作用以低濃度1,25(OH)_2VD_3(1×10~-1010 mol/L)處理轉(zhuǎn)染Txnip-shRNA慢病毒表達(dá)質(zhì)粒和未轉(zhuǎn)染的豬前體脂肪細(xì)胞,檢測細(xì)胞分化及成脂基因表達(dá)。1,25(OH)_2VD_3處理未轉(zhuǎn)染的對照細(xì)胞,細(xì)胞分化及FAS、PPARγ和ERK1/2 mRNA表達(dá)顯著降低(P(27)0.05),而Txnip表達(dá)水平顯著提高(P(27)0.01)。與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比,Txnip表達(dá)沉默顯著促進(jìn)了細(xì)胞分化、提高了ChREBP、FAS、PPARγ和ERK1/2表達(dá)(P(27)0.01),以1,25(OH)_2VD_3處理后,ChREBP mRNA表達(dá)沒有顯著變化,但FAS、PPARγ及ERK1/2表達(dá)顯著降低(P(27)0.01)。5.葡萄糖誘導(dǎo)豬脂肪細(xì)胞分化中Txnip的作用15 mmol/L的高濃度葡萄糖顯著促進(jìn)豬前體脂肪細(xì)胞分化(P0.05);無糖條件下,Txnip表達(dá)沉默或Txnip過表達(dá)對細(xì)胞分化沒有顯著影響;以葡萄糖處理Txnip表達(dá)沉默細(xì)胞,細(xì)胞分化水平顯著提高(P0.05),并顯著高于高糖處理的非轉(zhuǎn)染對照組細(xì)胞(P0.05);葡萄糖處理后,Txnip過表達(dá)細(xì)胞的分化顯著低于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞(P0.05),即Txnip過表達(dá)減弱了葡萄糖對脂肪細(xì)胞分化的促進(jìn)作用。綜上所述,低濃度1,25(OH)_2D_3促進(jìn)豬前體脂肪細(xì)胞增殖、抑制分化,高濃度1,25(OH)_2D_3抑制增殖而促進(jìn)分化,維生素D對豬前體脂肪細(xì)胞增殖和分化具有明顯的雙向作用。Txnip通過下調(diào)PPARγ表達(dá),抑制豬前體脂肪細(xì)胞分化,但其作用依賴于葡萄糖的存在;低濃度1,25(OH)_2VD_3可能通過誘導(dǎo)Txnip表達(dá)從而下調(diào)PPARγ抑制豬前體脂肪細(xì)胞分化。葡萄糖促進(jìn)豬前體脂肪細(xì)胞分化,而Txnip減弱葡萄糖對脂肪細(xì)胞分化的這種促進(jìn)作用。
【圖文】：

圖 1-1 豬前體脂肪細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察A：細(xì)胞培養(yǎng) 4 h；B：細(xì)胞培養(yǎng) 1 d；C：細(xì)胞培養(yǎng) 2 d；D：細(xì)胞培養(yǎng) 4 d；E：細(xì)胞培養(yǎng) 7 d；F：豬脂肪細(xì)胞 Bodipy 染色（7 d）；標(biāo)尺為 200 μmFig.1-1 The morphological analyses of porcine preadipocyte cellsA: Porcine preadipocyte cells cultured for 4 h; B: Porcine preadipocyte cells cultured for 1d ; C:Porcine preadipocyte cells cultured for 2 d; D: Porcine preadipocyte cells cultured for 4 d; E:Porcine preadipocyte cells cultured for 7 d; F: Bodipy staining of porcine preadipocyte cellscultured for 7 d. Scale bar is 200 μm

誘導(dǎo)分化后培養(yǎng)4d的豬前體脂肪細(xì)胞A-F依次是以終濃度為對照組、1×10-10、1×10-9、1×10-8、1×10-7和1×10-6mol/L的1,25(OH)
【學(xué)位授予單位】：西北民族大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S828

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 張國華;盧建雄;楊具田;臧榮鑫;申曉蓉;趙永清;霍生東;陳妍;;葡萄糖和含腺苷分子通過碳水化合物反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(ChREBP)誘導(dǎo)豬脂肪細(xì)胞硫氧還蛋白互作蛋白(Txnip)的表達(dá)[J];農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào);2014年03期

2 盧建雄;張國華;李昌輝;陳妍;霍生東;郭鵬輝;蔡勇;;ChREBP基因siRNA表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建及對原代培養(yǎng)豬脂肪細(xì)胞生脂的影響[J];中國農(nóng)業(yè)科學(xué);2013年24期

3 盧建雄;楊具田;臧榮鑫;申曉蓉;馬省強(qiáng);;胰島素對原代培養(yǎng)大鼠前體脂肪細(xì)胞增殖分化的影響[J];中國獸醫(yī)科學(xué);2006年11期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 李昌輝;豬脂肪細(xì)胞體外培養(yǎng)及葡萄糖和胰島素誘導(dǎo)生脂研究[D];西北民族大學(xué);2012年

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本文編號：2634782