【摘要】：中草藥在我國具有悠久的歷史,尤其在病毒性疾病防治方面具有獨特的優(yōu)勢。一些中草藥及其成分不僅能直接影響病毒復(fù)制,還能調(diào)節(jié)機體免疫功能。豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)和豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)是危害全球養(yǎng)豬業(yè)的重要病原,均可導(dǎo)致機體免疫抑制,引起其他病原微生物的繼發(fā)或并發(fā)感染,從而造成巨大的經(jīng)濟損失。因此,除了依靠疫苗免疫,探討控制PCV2和PRRSV感染的新策略十分必要。本研究從牛蒡子中提取活性成分牛蒡苷元(ACT),分析其在體內(nèi)外對PCV2和PRRSV的抗病毒活性,以期為豬圓環(huán)病毒病(PCVAD)、豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)的防控以及ACT的開發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。牛蒡子粗粉經(jīng)脫脂后用含5%鹽酸的50%乙醇溶液回流5h,過濾后藥渣用50%乙醇溶液重復(fù)提取1h,合并濾液,用5mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)至中性,氯仿萃取兩次,減壓旋轉(zhuǎn)蒸干后獲得ACT粗品,經(jīng)兩次硅膠柱層析純化獲得ACT;三批次提取的ACT平均百分含量為98.2%,平均提取率為1.62%。分析了 ACT對PCV2在PK-15細胞及小鼠體內(nèi)增殖的影響。結(jié)果顯示,15.6-62.5μg/mLACT能夠明顯抑制PCV2在PK-15細胞上的增殖(p0.01);進一步小鼠試驗顯示,按每公斤體重0.2mg腹腔注射ACT能夠明顯抑制PCV2在小鼠肺、脾及腹股溝淋巴結(jié)組織內(nèi)的增殖(p0.01)。分析了 ACT對人工感染PCV2仔豬體內(nèi)病毒增殖及組織病理學(xué)影響。結(jié)果顯示,攻毒前按劑量20μg/kg和50μg/kg連續(xù)給藥3天均能顯著抑制攻毒后7、14和21d仔豬外周血病毒載量(p0.05,p0.01);攻毒后21d將全部試驗仔豬剖殺,發(fā)現(xiàn)給藥組1(20 μg/kg)能顯著抑制PCV2在腹股溝淋巴結(jié)(p0.05)、腸系膜淋巴結(jié)(p0.05)組織中的增殖,給藥組2(50μg/kg)還能顯著抑制PCV2在扁桃體(p0.05)和肺(p0.05)組織中的增殖;病理切片和組織病理學(xué)評分結(jié)果顯示,兩個劑量ACT均能減輕PCV2感染造成的上述臟器組織的病理損傷。分析了 ACT對PRRSV體外增殖的影響。結(jié)果顯示,12.5-100μg/mL的ACT對1OOTCID50及10TCID50PRRSV均顯示出顯著的直接滅活作用(p0.01);0.39-100μg/mLACT能顯著抑制100TCID50及 10TCID50PRRSV 在 MARC-145 細胞的增殖(p0.01);而 0.19-100μg/mLACT 預(yù)處理細胞并不能影響PRRSV的感染和增殖。從細胞周期調(diào)控角度探討了 ACT抑制PCV2增殖的機理。結(jié)果顯示,62.5μg/mLACT能抑制PCV2感染導(dǎo)致的PK-15細胞S期延遲(p0.01);同時抑制CyclinE2、CDK2、p53的轉(zhuǎn)錄和表達。表明ACT可能通過抑制CyclinE2、CDK2、p53蛋白的表達影響細胞周期分布,從而抑制PCV2在PK-15細胞的增殖。綜上,本研究建立了一種簡便、穩(wěn)定的ACT制備方法,并對ACT在體內(nèi)外抗PCV2和PRRSV感染的作用和效果進行了研究分析。結(jié)果表明,ACT對PCV2在細胞、小鼠及仔豬的增殖均具有良好的抑制效果,在體外對PRRSV也具有一定的直接滅活和抑制作用,并發(fā)現(xiàn)ACT可能通過調(diào)控細胞周期抑制PCV2在PK-15細胞的增殖。研究結(jié)果為進一步挖掘ACT抗病毒機理及臨床防控PCVAD和PRRS提供了試驗依據(jù)。
【圖文】：

學(xué)博士學(xué)位論文邐第三章牛蒡苷元對ＰＣＶ２在ＰＫ－１５細胞及小鼠體內(nèi)增果逡逑Ｖ２定量ＰＣＲ檢測方法的建立逡逑定純化的ＰＣＶ２卩丨丨性克隆質(zhì)粒濃度為０．２ｐｇ／ｎＬ，折算含有ｌｘＫ＾ｃｏｐｉｅｓ爾Ｌ。將化質(zhì)粒進行１０倍梯度稀釋，進行擴增反應(yīng)，擴增曲線見圖２－１。標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖２為－３．９６７８９０，相關(guān)系數(shù)為０．９９６２９１，截距為５５．９０６４１４，直線方程為逡逑９０ｘ＋５５．９０６４１４，其中ｙ為循環(huán)閾值，ｘ為質(zhì)粒模板的拷貝數(shù)。逡逑［Ｊｔｌｌｉ邋Ｒｎ邋Ｃｖｃｌ？逡逑

學(xué)博士學(xué)位論文邐第三章牛蒡苷元對ＰＣＶ２在ＰＫ－１５細胞及小鼠體內(nèi)增果逡逑Ｖ２定量ＰＣＲ檢測方法的建立逡逑定純化的ＰＣＶ２卩丨丨性克隆質(zhì)粒濃度為０．２ｐｇ／ｎＬ，折算含有ｌｘＫ＾ｃｏｐｉｅｓ爾Ｌ。將化質(zhì)粒進行１０倍梯度稀釋，進行擴增反應(yīng)，，擴增曲線見圖２－１。標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖２為－３．９６７８９０，相關(guān)系數(shù)為０．９９６２９１，截距為５５．９０６４１４，直線方程為逡逑９０ｘ＋５５．９０６４１４，其中ｙ為循環(huán)閾值，ｘ為質(zhì)粒模板的拷貝數(shù)。逡逑［Ｊｔｌｌｉ邋Ｒｎ邋Ｃｖｃｌ？逡逑
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S853.7

【參考文獻】

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1 王衛(wèi)東;李超;唐仕榮;張小剛;;牛蒡子中牛蒡子苷的提取分離[J];食品科學(xué);2009年18期

2 林志娟;宋德懋;;細胞周期的調(diào)控——2001年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎工作介紹及研究進展[J];生理科學(xué)進展;2009年03期

3 王立芳;徐振曄;;中藥調(diào)節(jié)細胞周期的研究進展[J];中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報;2008年11期

4 劉X;;牛蒡子水煎液、牛蒡苷和牛蒡苷元體外抗菌實驗[J];天津藥學(xué);2008年04期

5 符林春;徐培平;劉妮;楊子峰;張奉學(xué);胡英杰;;牛蒡子苷元復(fù)方抗流感病毒的實驗研究[J];中藥新藥與臨床藥理;2008年04期

6 王潞;趙烽;劉珂;;牛蒡子苷元誘導(dǎo)人白血病細胞凋亡的作用及機制[J];藥學(xué)學(xué)報;2008年05期

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