【摘要】：犬Ⅰ型腺病毒(Canine adenovirus type 1,CAV-1)感染犬可引起犬傳染性肝炎(Infectious canine hepatitis,ICH),該病具有傳染性強(qiáng)、發(fā)病率高、致死率高的特點(diǎn),對犬養(yǎng)殖業(yè)造成了極大的危害和經(jīng)濟(jì)損失。本研究旨在建立CAV-1犬感染模型,以對評價ICH疫苗以及藥物的療效提供參考。首先,本實(shí)驗(yàn)建立了一系列CAV-1的檢測手段,包括分子生物學(xué)檢測方法PCR和定量PCR以及用于血清抗體檢測的血清學(xué)檢測方法間接免疫熒光試驗(yàn)(Indirect immunoinfluscent assay,IFA)和血凝抑制(Hemagglutnation inhibition,HI)試驗(yàn)。其次,我們利用普通級2月齡比格犬建立感染模型。對犬進(jìn)行肌肉注射接種CAV-1同劑量(10~5.7.7 TCID_(50)/2 mL)感染后,對其排毒情況、組織帶毒、病毒血癥進(jìn)行檢測。結(jié)果表明,三只攻毒犬出現(xiàn)不同程度的臨床癥狀、大體病變和組織學(xué)病毒分布:1、母源抗體水平低、體重輕的犬臨床癥狀最明顯,體溫升高最快并出現(xiàn)血便,體內(nèi)病毒擴(kuò)散最廣,組織中病毒含量最高;2、母源抗體水平低、體重大或母源抗體水平高、體重輕的犬均未見明顯的臨床癥狀;3、病毒的組織學(xué)分布程度說明在建立犬感染CAV-1模型時應(yīng)考慮單位體重的病毒接種劑量和犬的母源抗體,即在制備和評估發(fā)病模型時,必須考慮實(shí)驗(yàn)動物的本底質(zhì)量。利用普通級2月齡比格犬建立感染模型,通過后肢肌肉注射10~(5.2)TCID_(50)/kg犬腺病毒I型CAV-1株。各項(xiàng)指標(biāo)顯示,體溫于2 dpi達(dá)到最高值;臨床癥狀顯示2 dpi有便血,6 dpi有輕度腹瀉;排毒情況:于10 dpi口腔開始出現(xiàn)排毒情況;血液中病毒檢測于3 dpi病毒含量達(dá)到最高;病毒主要組織分布于胸腺,腹股溝淋巴結(jié),頜下淋巴結(jié),腸系膜淋巴結(jié),肝臟;血清抗體HI效價為1:320。為了探究CAV-1感染犬體內(nèi)發(fā)揮主導(dǎo)作用及有潛力藥用價值的干擾素(Interferon,IFN)類型,我們先后對體外CAV-1感染的犬腎上皮細(xì)胞系(Madin darby canine kidney,MDCK)、體內(nèi)CAV-1感染比格犬的血液及肝臟中各干擾素轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了檢測。結(jié)果表明,在體外,CAV-1處理的MDCK細(xì)胞中IFN-α轉(zhuǎn)錄水平較高,Poly I:C處理的MDCK細(xì)胞中IFN-λ1、IFN-λ3轉(zhuǎn)錄水平較高,并且可能先后發(fā)揮著重要作用。對于體內(nèi),感染犬的血液中干擾素受體分子IFN-βR、IFN-λ1R和IFN-λ3R最先開始大量轉(zhuǎn)錄,而肝臟中IFN-λ1R轉(zhuǎn)錄水平較高。本研究表明在治療犬傳染性肝炎發(fā)病犬時,應(yīng)更多考慮III型干擾素的作用。
【圖文】：

的疫苗或藥物，感染動物模型對于疫苗及藥物療效的評價至關(guān)重要。干擾素治療犬病（尹柏雙，等，2007），但對新發(fā)現(xiàn)的ⅠⅠⅠ型干擾中發(fā)揮作用，而犬腺病毒會引起感染犬的呼吸癥狀，故猜想ⅠⅠⅠ型本研究利用標(biāo)準(zhǔn)化的比格犬進(jìn)行人工感染實(shí)驗(yàn)建立動物感染模型，目打下基礎(chǔ)。同時對體內(nèi)各干擾素水平進(jìn)行了測定，以期為干擾素防制了參考。腺病毒概述構(gòu)于腺病毒科哺乳動物腺病毒屬，分為犬腺病毒 1 型和犬腺病毒 2 型（2, CAV-2）。CAV-1 屬于無囊膜病毒，其直徑約為 80 nm 左右。其形毒相似，均呈二十面體立體對稱結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)衣殼由 252 個殼粒組成、纖突等結(jié)構(gòu)(圖 1.1)。其中在五鄰體的纖突上有一個球狀物，球狀物細(xì)胞時可通過球狀物結(jié)合細(xì)胞受體。

圖 1.2 犬腺病毒Ⅰ型基因組圖Fig 1.2 Schematic diagram of genome of CAV-1CAV-1 核酸為線狀雙鏈 DNA 分子，基因組全長約為 31 kb 左右，CAV-2 基因組全長約為 32.2 kb左右，兩者同源性約為 70%左右，基因水平僅約有 56.6%的相關(guān)性(Jouvenne, et al., 1987)。可將CAV-1 基因組劃分為 E1-E4 和 L1-L5，其中 E1 和 E2 可分為 A 和 B 區(qū)域(Morrison, et al., 1997)，共編碼 15 種多肽(圖 1.2)，其中占總蛋白量 90%以上的最主要的結(jié)構(gòu)性蛋白包括五鄰體、六鄰體、纖突、核衣殼等。五鄰粒由基底和纖突組成，基底位于腺病毒二十面體的頂角，纖突與基底以非共價鍵相連，每個基底由 5 個多肽分子組成，纖突由 3 個多肽組成。纖突的氨基酸保守區(qū)位于底部，遠(yuǎn)端為 C 末端，中間由脯氨酸以及疏水性氨基酸殘基組成，這段基因不保守，與腺病毒的抗原特異性有關(guān)(王東，2009)。六鄰體上有補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)抗原，五鄰體為完全可溶性血凝素。各部分的抗原決定簇的結(jié)合特性有所差異，以六鄰體最明顯(Marusyk, et al., 1970; Marusyk, et al.,1972)。其中 E1 為必需區(qū)，E3 區(qū)為病毒復(fù)制非必需區(qū)，缺失 E3 對病毒的復(fù)制沒有影響(Short, et al.,2010; Kalyuzhniy, et al., 2008)。目前很多研究可用外源片段替代 E3 區(qū)插入到基因中，，使得腺病毒成為很好的載體(Xiu-Zhen Li, et al., 2015; 李秀博, 等, 2017; 葛艷華, 2009)。該病毒序列較保守，但最近有發(fā)現(xiàn)(Wong M, et al., 2017)CAV-1 毒株在 pVⅢ基因序列與 CAV-2 有所變異。1.2.2 宿主范圍
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S858.292

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本文編號：2634552