【摘要】：抗菌肽是一種廣泛存在于生物體內(nèi)的多肽,其分子量小、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定�？咕木哂懈咝У目辜毦�、抗腫瘤、抗真菌、抗寄生蟲、抗病毒作用,其獨特的作用機制使細菌不易產(chǎn)生耐藥性,因而成為科學(xué)家關(guān)注熱點。顆粒溶素(Granulysin,GNLY)和大多數(shù)抗菌肽一樣,能夠殺滅多種微生物以及寄生蟲,參與機體內(nèi)免疫應(yīng)答,是機體天然免疫的重要組成。有關(guān)綿羊抗菌肽GNLY研究內(nèi)容較少,其基因在不同品種綿羊中是否存在差異尚不確定。目的:為了分析不同品種綿羊抗菌肽GNLY基因的SNP多態(tài)性,對新疆地區(qū)薩�？搜�、美利奴羊、湖羊三個品種GNLY基因CDS區(qū)測序,利用生物信息學(xué)方法預(yù)測GNLY二級結(jié)構(gòu),推測氨基酸序列變化與蛋白結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系;人工合成幾條基于GNLY基因的多肽,測定合成多肽體外抑菌等生物學(xué)活性;挑選體外活性較強的多肽對小鼠乳房炎模型的進行治療,測定合成多肽在體內(nèi)的作用,為研發(fā)動物用抗感染藥物提供科學(xué)依據(jù)。方法:(1)、通過采集薩�？搜�、美利奴羊、湖羊外周血并提取RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA后進行PCR擴增,對PCR產(chǎn)物進行測序分析。利用GNLY核苷酸序列推導(dǎo)出的氨基酸序列,再運用軟件分析預(yù)測GNLY的二級結(jié)構(gòu),根據(jù)綿羊顆粒溶素GNLY和其單核苷酸多態(tài)性基因的推導(dǎo)的氨基酸序列設(shè)計多肽,按照保留其兩親性的a-螺旋和LOOP結(jié)構(gòu)的設(shè)計原則,選取不同長度的多肽序列,設(shè)計合成多肽G16、G22、GS16、GC16。(2)、通過徑向擴散試驗和MIC試驗檢測合成多肽對大腸桿菌、沙門氏桿菌、葡萄球菌、金黃色葡萄球菌的抑制作用;利用MTT試驗觀察合成多肽對人食管癌細胞(EC109)、人腎癌細胞(X786-0)的抑制作用。(3)、通過兔紅細胞溶血試驗驗證合成多肽GC16的毒性;取分娩后8-10天的昆明系小鼠隨機等量分為4組,分別記為PBS對照組(即不治療)、多肽GC16治療組、抗生素AMP治療組、空白對照組。除空白對照組,其余每只小鼠均注射金黃色葡萄球菌,8 h后分別用PBS、GC16、AMP進行治療。24 h后全部脫頸處死,取部分組織做病理切片觀察,其余組織做CFU計數(shù)和TNF-α檢測。結(jié)果:(1)、綿羊GNLY的二級結(jié)構(gòu)含有8個α-螺旋和6個LOOP結(jié)構(gòu);根據(jù)測序結(jié)果分析,GNLY基因在薩�？搜�、美利奴羊、湖羊體內(nèi)核苷酸序列、氨基酸序列略有差異,與Genbank序列核苷酸同源性為91.85%、93.78%、92.35%,氨基酸同源性為93.15%、93.68%、92.47%。(2)、MIC試驗中濃度大于250μg/m L的G16對大腸桿菌、葡萄球菌有抑制作用;濃度大于15μg/m L的GS16對大腸桿菌抑制作用明顯,但對沙門氏桿菌、葡萄球菌以及金黃色葡萄球菌無明顯的抑菌效果;濃度為62.5μg/mL的GC16對四種細菌均有抑制作用,其中,對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果較為突出;而G22對四種細菌均無顯著的抗菌效果;MTT試驗結(jié)果表明合成多肽G16、GS16對癌細胞無抑制作用,G22和GC16對人食管癌細胞(EC109)、人腎癌細胞(X786-0)具有顯著抑制作用,其中1 mg/mL G22和1 mg/mL GC16對EC109生長抑制率分別為88.21%,57.21%,對X786-0生長抑制率分別為96.37%和81.87%。(3)、溶血試驗可知多肽對兔紅細胞幾乎沒有毒性;動物試驗中,觀察PBS治療組病理切片發(fā)現(xiàn)有炎性細胞浸潤、充血、出血,腺泡組織不完整,組織間隙有大量細胞團塊,金黃色葡萄球菌CFU計數(shù)和TNF-α水平明顯高于其他3組(P0.05);多肽治療組和抗生素治療組沒有明顯的病理變化,乳腺中含有少量乳汁,乳腺上皮細胞及脂肪細胞正常,間質(zhì)中偶見個別淋巴細胞,乳腺組織結(jié)構(gòu)基本完整,但是多肽治療組CFU計數(shù)和TNF-α顯著低于抗生素組(P0.05)。結(jié)論:研究顯示GNLY基因在不同品種綿羊中存在豐富的多態(tài)性,預(yù)測其二級結(jié)構(gòu)含有8個α-螺旋和6個LOOP結(jié)構(gòu);合成GNLY多肽在體外試驗中對細菌和腫瘤細胞具有抑制活性,對小鼠乳腺炎模型治療具有良好的效果,本研究為綿羊抗菌肽GNLY作為備選抑菌藥物的研發(fā)打下了基礎(chǔ)。
【圖文】：

NLY 基因多態(tài)性分析及合成多肽對小鼠乳房炎模型治療拔起，把瓊脂糖凝膠連帶電泳板轉(zhuǎn)移至電泳槽中L PCR 產(chǎn)物，120 V，50 mA 電泳 30 min。照，并把剩余 PCR 產(chǎn)物送至上海生工進行測序。泳結(jié)果薩�？司d羊 GNLY 電泳結(jié)果，圖 1-2 表示的是美是湖羊 GNLY 電泳結(jié)果，電泳結(jié)果均在 460 bp 生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行 DNA 雙向測序綿羊 GNLY 基因序列完全相符。因此，，該 PCR果 466 bp 相同。

圖 1-2 美利奴綿羊 GNLY 電泳結(jié)果Figure1-2 Production of PCR of Merino Sheep注：1-12：美利奴羊 PCR 后產(chǎn)物 M：Marker ⅠPS：1-12：Production of PCR M：Marker ⅠM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12bpbpbp bp bpbp4
【學(xué)位授予單位】：石河子大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S859.79

【參考文獻】

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本文編號：2634192