發(fā)布時間：2020-04-20 05:09

【摘要】：抗菌肽是一種廣泛存在于生物體內的多肽,其分子量小、化學性質穩(wěn)定�？咕木哂懈咝У目辜毦�、抗腫瘤、抗真菌、抗寄生蟲、抗病毒作用,其獨特的作用機制使細菌不易產生耐藥性,因而成為科學家關注熱點。顆粒溶素(Granulysin,GNLY)和大多數抗菌肽一樣,能夠殺滅多種微生物以及寄生蟲,參與機體內免疫應答,是機體天然免疫的重要組成。有關綿羊抗菌肽GNLY研究內容較少,其基因在不同品種綿羊中是否存在差異尚不確定。目的:為了分析不同品種綿羊抗菌肽GNLY基因的SNP多態(tài)性,對新疆地區(qū)薩�？搜�、美利奴羊、湖羊三個品種GNLY基因CDS區(qū)測序,利用生物信息學方法預測GNLY二級結構,推測氨基酸序列變化與蛋白結構和功能的關系;人工合成幾條基于GNLY基因的多肽,測定合成多肽體外抑菌等生物學活性;挑選體外活性較強的多肽對小鼠乳房炎模型的進行治療,測定合成多肽在體內的作用,為研發(fā)動物用抗感染藥物提供科學依據。方法:(1)、通過采集薩�？搜�、美利奴羊、湖羊外周血并提取RNA,反轉錄為cDNA后進行PCR擴增,對PCR產物進行測序分析。利用GNLY核苷酸序列推導出的氨基酸序列,再運用軟件分析預測GNLY的二級結構,根據綿羊顆粒溶素GNLY和其單核苷酸多態(tài)性基因的推導的氨基酸序列設計多肽,按照保留其兩親性的a-螺旋和LOOP結構的設計原則,選取不同長度的多肽序列,設計合成多肽G16、G22、GS16、GC16。(2)、通過徑向擴散試驗和MIC試驗檢測合成多肽對大腸桿菌、沙門氏桿菌、葡萄球菌、金黃色葡萄球菌的抑制作用;利用MTT試驗觀察合成多肽對人食管癌細胞(EC109)、人腎癌細胞(X786-0)的抑制作用。(3)、通過兔紅細胞溶血試驗驗證合成多肽GC16的毒性;取分娩后8-10天的昆明系小鼠隨機等量分為4組,分別記為PBS對照組(即不治療)、多肽GC16治療組、抗生素AMP治療組、空白對照組。除空白對照組,其余每只小鼠均注射金黃色葡萄球菌,8 h后分別用PBS、GC16、AMP進行治療。24 h后全部脫頸處死,取部分組織做病理切片觀察,其余組織做CFU計數和TNF-α檢測。結果:(1)、綿羊GNLY的二級結構含有8個α-螺旋和6個LOOP結構;根據測序結果分析,GNLY基因在薩�？搜�、美利奴羊、湖羊體內核苷酸序列、氨基酸序列略有差異,與Genbank序列核苷酸同源性為91.85%、93.78%、92.35%,氨基酸同源性為93.15%、93.68%、92.47%。(2)、MIC試驗中濃度大于250μg/m L的G16對大腸桿菌、葡萄球菌有抑制作用;濃度大于15μg/m L的GS16對大腸桿菌抑制作用明顯,但對沙門氏桿菌、葡萄球菌以及金黃色葡萄球菌無明顯的抑菌效果;濃度為62.5μg/mL的GC16對四種細菌均有抑制作用,其中,對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果較為突出;而G22對四種細菌均無顯著的抗菌效果;MTT試驗結果表明合成多肽G16、GS16對癌細胞無抑制作用,G22和GC16對人食管癌細胞(EC109)、人腎癌細胞(X786-0)具有顯著抑制作用,其中1 mg/mL G22和1 mg/mL GC16對EC109生長抑制率分別為88.21%,57.21%,對X786-0生長抑制率分別為96.37%和81.87%。(3)、溶血試驗可知多肽對兔紅細胞幾乎沒有毒性;動物試驗中,觀察PBS治療組病理切片發(fā)現有炎性細胞浸潤、充血、出血,腺泡組織不完整,組織間隙有大量細胞團塊,金黃色葡萄球菌CFU計數和TNF-α水平明顯高于其他3組(P0.05);多肽治療組和抗生素治療組沒有明顯的病理變化,乳腺中含有少量乳汁,乳腺上皮細胞及脂肪細胞正常,間質中偶見個別淋巴細胞,乳腺組織結構基本完整,但是多肽治療組CFU計數和TNF-α顯著低于抗生素組(P0.05)。結論:研究顯示GNLY基因在不同品種綿羊中存在豐富的多態(tài)性,預測其二級結構含有8個α-螺旋和6個LOOP結構;合成GNLY多肽在體外試驗中對細菌和腫瘤細胞具有抑制活性,對小鼠乳腺炎模型治療具有良好的效果,本研究為綿羊抗菌肽GNLY作為備選抑菌藥物的研發(fā)打下了基礎。
【圖文】：

NLY 基因多態(tài)性分析及合成多肽對小鼠乳房炎模型治療拔起，把瓊脂糖凝膠連帶電泳板轉移至電泳槽中L PCR 產物，120 V，50 mA 電泳 30 min。照，并把剩余 PCR 產物送至上海生工進行測序。泳結果薩�？司d羊 GNLY 電泳結果，圖 1-2 表示的是美是湖羊 GNLY 電泳結果，電泳結果均在 460 bp 生物工程技術服務有限公司進行 DNA 雙向測序綿羊 GNLY 基因序列完全相符。因此，，該 PCR果 466 bp 相同。

圖 1-2 美利奴綿羊 GNLY 電泳結果Figure1-2 Production of PCR of Merino Sheep注：1-12：美利奴羊 PCR 后產物 M：Marker ⅠPS：1-12：Production of PCR M：Marker ⅠM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12bpbpbp bp bpbp4
【學位授予單位】：石河子大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S859.79

【參考文獻】

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1 李燕榮;蘭鄒然;姜平;;新型抗生素替代品研究進展[J];當代畜牧;2014年09期

2 李冠楠;夏雪娟;隆耀航;李姣蓉;武婧潔;朱勇;;抗菌肽的研究進展及其應用[J];動物營養(yǎng)學報;2014年01期

3 胡燁;馬吉飛;趙瑞利;;抗菌肽作為飼料添加劑的研究進展[J];天津農學院學報;2013年04期

4 問鑫;高鳳仙;;抗菌肽殺菌機制的研究進展[J];中國飼料;2013年24期

5 梁英;;抗菌肽的來源及應用[J];動物營養(yǎng)學報;2014年01期

6 萬玲;王梅梅;孔令聰;裴志花;劉樹明;馬紅霞;;家蠅基因工程抗菌肽的研究進展[J];中國獸藥雜志;2013年10期

7 孫紅;薛越;黃寧;;抗菌肽抗菌機制的研究進展[J];中國抗生素雜志;2013年08期

8 趙瑞利;韓文瑜;韓俊友;金天明;馮新;雷連成;孫長江;王選;;新型牛蛙抗菌肽Temporin-La對金黃色葡萄球菌感染模型小鼠的治療效果[J];中國生物制品學雜志;2013年08期

9 孫長峰;仲維霞;王洪法;;抗菌肽作用機制及改造策略研究進展[J];中國病原生物學雜志;2013年07期

10 牛淑玲;;抗菌肽在動物生產中的研究現狀、應用及展望[J];飼料與畜牧;2013年06期

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1 枚春成（MAI XUAN THANH）;二級結構對抗菌肽的抗菌活性及特異性的影響[D];吉林大學;2013年

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1 張殿卿;合成綿羊抗菌肽NK-Lysin的生物學功能及其對雛雞沙門氏菌感染的治療研究[D];石河子大學;2014年

2 王笑非;疏水性對抗HeLa多肽活性的影響及抗癌機理的初步研究[D];吉林大學;2010年

本文編號：2634192