【摘要】：非洲豬瘟(African swine fever,ASF)血清學(xué)診斷方法主要有免疫熒光試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和免疫轉(zhuǎn)印試驗(yàn),其中ELISA抗體檢測(cè)方法有世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)推薦的ELISA方法和商品化ELISA試劑盒,前者以病毒感染細(xì)胞提取抗原為檢測(cè)抗原,只能在ASF參考實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行;后者供應(yīng)量和檢測(cè)敏感性均不能滿足實(shí)際需要。非洲豬瘟病毒(ASFV)p54和B602L編碼蛋白是強(qiáng)免疫原性抗原,盡管重組p54和B602L抗原國內(nèi)已有報(bào)道,但均帶組氨酸標(biāo)簽,不僅需用價(jià)格較貴鎳親和柱純化,而且與帶組氨酸標(biāo)簽重組亞單位疫苗免疫豬血清有交叉反應(yīng)。本研究分別將ASFV p54和B602L與類彈性蛋白多肽(ELP)進(jìn)行融合表達(dá),用煙草蝕紋病毒(TEV)蛋白酶活性包涵體切除ELP標(biāo)簽,旨在簡(jiǎn)化重組抗原制備工藝和避免融合標(biāo)簽引起的交叉反應(yīng)。首先以不同融合方向分別將ASFV p54和B602L基因克隆入ELP融合表達(dá)載體,將重組載體 pELP-P54、pP54-ELP、pELP-B602L 和 pB602L-ELP 轉(zhuǎn)化大腸桿菌,用 IPTG 誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá),結(jié)果顯示P54-ELP和B602L-ELP融合蛋白不能表達(dá),ELP-P54和ELP-B602L融合蛋白能有效表達(dá)。ELP-P54和ELP-B602L融合蛋白的相變溫度分別為28℃和26℃。在0.5%Triton X-100和2mol/L氯化鈉存在條件下,相變循環(huán)純化的ELP-P54融合蛋白純度大于90%,ELP-B602L融合蛋白純度大于85%。用TEV蛋白酶活性包涵體切除融合蛋白的ELP標(biāo)簽,結(jié)果顯示切割效率均大于95%,回收的無標(biāo)簽重組p54和B602L蛋白純度大于90%。免疫轉(zhuǎn)印試驗(yàn)顯示無標(biāo)簽重組p54和B602L蛋白能被ASFV抗體陽性血清識(shí)別。分別以不同濃度重組p54和B602L蛋白為包被抗原,與不同稀釋倍數(shù)ASFV抗體陽性和陰性血清進(jìn)行ELISA反應(yīng),結(jié)果顯示與抗體陰性血清反應(yīng)陰性,與抗體陽性血清反應(yīng)陽性,OD450值與血清稀釋倍數(shù)呈良好的線性關(guān)系。用重組p54、B602L抗原與本課題組制備的無標(biāo)簽重組K205R抗原建立混合抗原ELISA方法,對(duì)47份ASFV感染存活豬血清進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示45份為ASFV抗體檢測(cè)陽性,與p54抗原膠體金試紙條檢測(cè)結(jié)果一致,檢測(cè)敏感性為96%。用Ingenasa公司ELISA試劑盒對(duì)47份豬血清進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示23份血清為ASFV抗體檢測(cè)陽性,4份為可疑,檢測(cè)敏感性為49%。這些研究資料表明ASFV無標(biāo)簽重組p54和B602L抗原可以用于ASFV抗體檢測(cè)。
【圖文】：

消化ＰＥＬＰ－Ｂ６０２Ｌ融合表達(dá)載體，瓊脂糖凝膠電泳顯示與預(yù)期相符的約１．８ｋｂ插入片段；逡逑用限制性內(nèi)切酶Ｂｇｌｌｌ和ＥｃｏＲＩ消化ｐＢ６０２Ｌ－ＥＬＰ融合表達(dá)，瓊脂糖凝膠電泳顯示與預(yù)期逡逑相符的約１．８ｋｂ插入片段（圖１－２）。逡逑Ｍｌ邐Ｍｌ邐Ｍｌ邐Ｍｌ逡逑＾＇°ｒ邋＇ｂＦ逡逑．＇９－ｖｅｃｔ0（邐＾＾■＾Ｍ？－ｖｅｃｔ0ｒ邋§000邋■，，逡逑＾邐２０（？＾Ｈ＾Ｂ６０２Ｌ逡逑■：榻卜；逡逑：■邋，ｏｉ逡逑W 逡逑Ａ邐Ｂ邐Ｃ邐Ｄ逡逑圖１－２融合表達(dá)載體酶切鑒定逡逑Ｆｉｇ．邋１．２邋Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ邋ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ邋ｆｕｓｉｏｎ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｖｅｃｔｏｒｓ逡逑Ａ：邋Ｍ：邋ＤＬｌＯＯＯＭａｒｋｅｒ；邋１：邋ｐＥＬＰ－Ｐ５４邋載體酶切逡逑Ｂ：邋Ｍ：邋ＤＬｌＯＯＯＭａｒｋｅｒ；邋１：邋ｐＰ５４－ＥＬＰ邋載體酶切逡逑Ｃ：邋Ｍ：邋ＤＬ５０００Ｍａｒｋｅｒ；邋１：邋ｐＥＬＰ－Ｂ６０２Ｌ邋載體酶切逡逑Ｄ：邋Ｍ：邋ＤＬ５０００Ｍａｒｋｅｒ；邋１：邋ｐＢ６０２Ｌ－ＥＬＰ邋載體酶切逡逑２．２．融合蛋白表達(dá)逡逑將重組表達(dá)載體邋ＰＥＬＰ－Ｐ５４、ｐＰ５４－ＥＬＰ、ｐＥＬＰ－Ｂ６０２Ｌ、ｐＢ６０２Ｌ－ＥＬＰ邋轉(zhuǎn)化入邋ＢＬ２１邋（ＤＥ３）逡逑大腸桿菌

邐Ｂ６０２Ｌ邐ＥＬＰ逡逑圖１－１融合表達(dá)載體結(jié)構(gòu)示意閣逡逑Ｆｉｇ．邋１．１邋Ｔｈｅ邋ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ｆｌｉｓｉｏｎ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｖｅｃｔｏｒｓ逡逑用限制性內(nèi)切酶ＳａｃＩ和Ｘｈ0ｒ消化ＰＥＬＰ－Ｐ５４融合表達(dá)載體，瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)與逡逑預(yù)期相符的約４２４ｂｐ插入基因片段；限制性內(nèi)切酶Ｎｄｅｌ和ＥｃｏＲＩ消化ｐＰ５４－ＥＬＰ融合表達(dá)逡逑載體，瓊脂糖凝膠電泳顯示與預(yù)期相符的約４２４ｂｐ插入片段；用限制性內(nèi)切酶ＳａｃＩ和Ｎｏｔｌ逡逑消化ＰＥＬＰ－Ｂ６０２Ｌ融合表達(dá)載體，瓊脂糖凝膠電泳顯示與預(yù)期相符的約１．８ｋｂ插入片段；逡逑用限制性內(nèi)切酶Ｂｇｌｌｌ和ＥｃｏＲＩ消化ｐＢ６０２Ｌ－ＥＬＰ融合表達(dá)，瓊脂糖凝膠電泳顯示與預(yù)期逡逑相符的約１．８ｋｂ插入片段（圖１－２）。逡逑Ｍｌ邐Ｍｌ邐Ｍｌ邐Ｍｌ逡逑＾＇°ｒ邋＇ｂＦ逡逑．＇９－ｖｅｃｔ0（邐＾＾■＾Ｍ？－ｖｅｃｔ0ｒ邋§000邋■，逡逑＾邐２０（？＾Ｈ＾Ｂ６０２Ｌ逡逑■：榻卜；逡逑：■邋
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S852.651

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本文編號(hào)：2634092