【摘要】：硫酸黏菌素(Colistin Sulfate,CLS),又名多黏菌素E(Polymyxin E)、黏桿菌素,是由多黏類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)產(chǎn)生的多肽類抗生素,主要用于敏感菌的防治,也曾被作為生長(zhǎng)促進(jìn)劑在畜禽飼料中廣泛使用。由于CLS具有腎毒和神經(jīng)毒等毒性,人體長(zhǎng)期攝入CLS殘留超標(biāo)的食物,極易對(duì)健康造成嚴(yán)重的影響。目前,我國(guó)農(nóng)業(yè)部已禁止將CLS作為動(dòng)物生長(zhǎng)促進(jìn)劑使用。為防止CLS的濫用和非法添加,需采用有效的檢測(cè)方法對(duì)動(dòng)物性食品中CLS的殘留進(jìn)行監(jiān)控。目前,針對(duì)CLS殘留建立的檢測(cè)方法包括微生物法、液相色譜法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法、毛細(xì)管色譜法等,這些方法所需要的儀器設(shè)備均比較昂貴,且操作方法繁瑣、費(fèi)時(shí),并要求檢測(cè)人員必須具備專業(yè)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。因此,迫切需要建立針對(duì)CLS檢測(cè)的快速、簡(jiǎn)便、靈敏度高的方法。本研究通過單克隆抗體制備技術(shù)及酶聯(lián)免疫吸附技術(shù),建立了針對(duì)動(dòng)物性食品中CLS檢測(cè)的ELISA方法,該檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單且靈敏度高,適合畜牧養(yǎng)殖和動(dòng)物產(chǎn)品加工中的快速檢測(cè)。1、CLS完全抗原的合成與鑒定CLS是小分子多肽物質(zhì),屬于半抗原,不具備免疫原性。試驗(yàn)采用異型雙功能交聯(lián)劑3-馬來酰亞胺基苯甲酸琥珀酰亞胺酯(3-Maleimidobenzoicacid-N-hydroxysuccinimide ester,MBS)將CLS分子中的活性氨基(-NH2)與二硫蘇糖醇還原BSA二硫鍵后引入的巰基(-SH)進(jìn)行偶聯(lián),使CLS分子與載體蛋白之間形成一間隔臂,合成了 CLS-BSA免疫抗原。采用戊二醛兩步法將CLS的-NH2與載體蛋白OVA的-NH2進(jìn)行偶聯(lián),合成了CLS-OVA包被抗原。通過SDS-PAGE、紫外掃描和免疫學(xué)方法對(duì)合成完全抗原進(jìn)行了鑒定,結(jié)果確定CLS與載體蛋白偶聯(lián)成功。使用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)得CLS-BSA和CLS-OVA 的蛋白濃度分別為 1.8mg/mL、4.6mg/mL。2、CLS單克隆抗體的制備利用完全抗原CLS-BSA以常規(guī)免疫程序免疫BALB/c小鼠,五次免疫后測(cè)得免疫小鼠血清效價(jià)為1:12800以上。利用雜交瘤細(xì)胞技術(shù)將免疫鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合后,采用ELISA方法和梯度稀釋法對(duì)融合細(xì)胞進(jìn)效價(jià)檢測(cè)和篩選,獲得了 3株能穩(wěn)定分泌抗CLS單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株3A2、5E2、9G7。采用小鼠體內(nèi)誘生法分別制得腹水 7 mL、14.7 mL、12.4 mL,其蛋白濃度分別為 14.32 mg/mL、32.57 mg/mL、21.8 mg/mL。抗體經(jīng)鑒定亞型為IgM,輕鏈為κ鏈。通過ELISA法對(duì)抗體效價(jià)進(jìn)行檢測(cè),均可達(dá)到1:12800以上,且與桿菌肽、莫能霉素鈉、鹽酸萬古霉素均無明顯的交叉反應(yīng),抗體特異性較好。3、CiELISA檢測(cè)方法的建立利用5E2腹水建立方陣ELISA試驗(yàn)確定檢測(cè)抗原的最佳工作濃度為1:5000,抗體的工作濃度為1:3200,最佳封閉液為0.5%明膠,以此建立檢測(cè)CLS的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法。當(dāng)CLS的添加濃度在10～1000ng/mL范圍時(shí),標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好,線性方程為y=0.4441x—0.3691(R2=0.9925),其 IC50 為 89.57 ng/mL,LOD 為 9.66 ng/mL,LOQ 為25.71 ng/mL。4、豬肉中CLS添加回收實(shí)驗(yàn)利用豬肉樣品作為基質(zhì)進(jìn)行CLS的添加回收實(shí)驗(yàn),將酸化處理后的豬肉樣品做8倍稀釋后,即可基本消除樣品基質(zhì)的干擾。當(dāng)CLS濃度在20～1000ng/mL范圍時(shí)線性關(guān)系良好,線性方程為 y=0.4661x-0.4432(R2=0.9903)。添加 50、500、1000ng/mL 的 CLS回收率在78.66～104.02%之間,變異系數(shù)在3.25～6.86%之間。
【圖文】：

Ｃ：硫酸黏菌素；Ｏ：雞卵清白蛋白；ＧＡ：戊＿＾？酸。逡逑：偶聯(lián)反應(yīng)３０邋ｍｉｎ的監(jiān)測(cè)；ｂ：偶聯(lián)反應(yīng)ｌｈ的監(jiān)測(cè)；ｃ：偶聯(lián)反應(yīng)１．５邋ｈ的監(jiān)測(cè)。逡逑圖２４邋ＴＬＣ法對(duì)包被原合成的監(jiān)測(cè)逡逑Ｃ：邋Ｃｏｌｉｓｔｉｎ邋Ｓｕｌｆａｔｅ；邋Ｏ：邋Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ；邋ＧＡ：邋Ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ．逡逑ｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｃｏｕｐｌｉｎｇ邋ｒｅａｃｔｉｏｎ邋ｆｏｒ邋３０邋ｍｉｎｕｔｅｓ；邋ｂ：邋Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｃｏｕｐｌｉｎｇ邋ｒｅａｃｔｉｏｎ邋ｆｏｒ邋１Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｃｏｕｐｌｉｎｇ邋ｒｅａｃｔｉｏｎ邋ｆｏｒ邋１．５邋ｈｏｕｒｓ．逡逑Ｆｉｇ．２－４邋Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｃｏａｔｉｎｇ邋ａｎｔｉｇｅｎ邋ｂｙ邋ＴＬＣ邋ｍｅｔｈｏｄ逡逑抗原蛋白濃度的測(cè)定結(jié)果逡逑ＣＡ法撿測(cè)蛋白濃度，以測(cè)得的ＯＤ５６２ｎｍ值為橫坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度為準(zhǔn)蛋白數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖２－５。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，，將測(cè)得的待測(cè)樣品，計(jì)算出ＣＬＳ－ＢＳＡ的蛋白濃度為１．８邋ｍｇ／ｘｎＬ，ＣＬＳ－ＯＶＡ的蛋白濃度為４．６邋０．６逡逑ｙ邋＝邋０．９７１ｘ－０．１０１２逡逑°＇５邐Ｒ２＝邋０．９９９１逡逑。４逡逑

Ｃ：硫酸黏菌素；Ｏ：雞卵清白蛋白；ＧＡ：戊＿＾？酸。逡逑ａ：偶聯(lián)反應(yīng)３０邋ｍｉｎ的監(jiān)測(cè)；ｂ：偶聯(lián)反應(yīng)ｌｈ的監(jiān)測(cè)；ｃ：偶聯(lián)反應(yīng)１．５邋ｈ的監(jiān)測(cè)。逡逑圖２４邋ＴＬＣ法對(duì)包被原合成的監(jiān)測(cè)逡逑Ｃ：邋Ｃｏｌｉｓｔｉｎ邋Ｓｕｌｆａｔｅ；邋Ｏ：邋Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ；邋ＧＡ：邋Ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ．逡逑ａ：邋Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｃｏｕｐｌｉｎｇ邋ｒｅａｃｔｉｏｎ邋ｆｏｒ邋３０邋ｍｉｎｕｔｅｓ；邋ｂ：邋Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｃｏｕｐｌｉｎｇ邋ｒｅａｃｔｉｏｎ邋ｆｏｒ邋１邋ｈｏｕｒ；邋ｃ：逡逑Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｃｏｕｐｌｉｎｇ邋ｒｅａｃｔｉｏｎ邋ｆｏｒ邋１．５邋ｈｏｕｒｓ．逡逑Ｆｉｇ．２－４邋Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｃｏａｔｉｎｇ邋ａｎｔｉｇｅｎ邋ｂｙ邋ＴＬＣ邋ｍｅｔｈｏｄ逡逑２．２完全抗原蛋白濃度的測(cè)定結(jié)果逡逑利用ＢＣＡ法撿測(cè)蛋白濃度，以測(cè)得的ＯＤ５６２ｎｍ值為橫坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度為縱坐標(biāo)，逡逑將測(cè)得的標(biāo)準(zhǔn)蛋白數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖２－５。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，將測(cè)得的待測(cè)樣品ＯＤ５６２邋ｎｍ逡逑值代入公式，計(jì)算出ＣＬＳ－ＢＳＡ的蛋白濃度為１．８邋ｍｇ／ｘｎＬ，ＣＬＳ－ＯＶＡ的蛋白濃度為４．６邋ｍｇ／ｍＬ。逡逑０．６逡逑ｙ邋＝邋０．９７１ｘ－０．１０１２逡逑°＇５邐Ｒ２＝邋０．９９９１逡逑４。４逡逑Ｊ邋０３邋－逡逑Ｔｋ邋０．２邋－邐ｊＴ逡逑妄。１逡逑０邋－Ｉ邐￣．邐．邐．邐１邐１邐．逡逑０邐０．１邐０．２邐０．３邐０．４邐０．５邐０．６邐０．７逡逑吸光度值Ｕｓ６２）逡逑圖２－５邋ＢＣＡ法檢測(cè)蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線逡逑Ｆｉｇ．
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S859.84

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 ;政府要聞[J];豬業(yè)科學(xué);2016年08期

2 晨曦;;硫酸黏菌素將禁用[J];農(nóng)業(yè)知識(shí);2016年27期

3 ;關(guān)于硫酸黏菌素預(yù)混劑標(biāo)準(zhǔn)的最新修訂稿[J];四川畜牧獸醫(yī);2016年07期

4 范葶莉;彭金菊;孫永學(xué);牛金利;蘇愷;馬驛;;硫酸黏菌素對(duì)土壤細(xì)菌耐藥性的影響[J];中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志;2018年05期

5 ;政務(wù)[J];廣東飼料;2016年08期

6 ;飼料[J];飼料廣角;2016年15期

7 代重山;李繼昌;林巍;王鳳霞;孫美成;李健;;硫酸黏菌素對(duì)小鼠坐骨-脛神經(jīng)毒性作用的電生理表現(xiàn)[J];中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志;2012年06期

8 趙暉;劉軼秋;王小慈;楊秀玉;;阿莫西林、硫酸黏菌素混懸注射液無菌檢查方法研究[J];中國(guó)動(dòng)物檢疫;2011年01期

9 ;中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告 第2428號(hào)[J];中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公報(bào);2016年08期

10 庫(kù)麗扎達(dá)·木拉提;;HPLC法測(cè)定硫酸黏菌素發(fā)酵液含量方法探討[J];草食家畜;2019年02期

相關(guān)會(huì)議論文 前9條

1 林洋;陳婷婷;湯樹生;;硫酸黏菌素的高效液相色譜檢測(cè)方法的研究[A];中國(guó)毒理學(xué)會(huì)獸醫(yī)毒理學(xué)委員會(huì)與中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)獸醫(yī)食品衛(wèi)生學(xué)分會(huì)聯(lián)合學(xué)術(shù)研討會(huì)暨中國(guó)毒理學(xué)會(huì)獸醫(yī)毒理學(xué)委員會(huì)第5次全國(guó)會(huì)員代表大會(huì)會(huì)議論文集[C];2017年

2 林巍;李繼昌;;硫酸黏菌素在小鼠體內(nèi)毒代動(dòng)力學(xué)研究[A];中國(guó)毒理學(xué)會(huì)獸醫(yī)毒理學(xué)與飼料毒理學(xué)學(xué)術(shù)討論會(huì)暨獸醫(yī)毒理專業(yè)委員會(huì)第4次全國(guó)代表大會(huì)會(huì)議論文集[C];2012年

3 林巍;李繼昌;;硫酸黏菌素致小鼠神經(jīng)細(xì)胞毒性研究[A];中國(guó)毒理學(xué)會(huì)獸醫(yī)毒理學(xué)與飼料毒理學(xué)學(xué)術(shù)討論會(huì)暨獸醫(yī)毒理專業(yè)委員會(huì)第4次全國(guó)代表大會(huì)會(huì)議論文集[C];2012年

4 文雪梅;吳莉芩;徐楊峰;文雪梅;顏國(guó)慶;何家康;;鹽酸林可霉素-硫酸黏菌素混懸液的初步安全性試驗(yàn)[A];中國(guó)毒理學(xué)會(huì)獸醫(yī)毒理學(xué)委員會(huì)與中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)獸醫(yī)食品衛(wèi)生學(xué)分會(huì)聯(lián)合學(xué)術(shù)研討會(huì)暨中國(guó)毒理學(xué)會(huì)獸醫(yī)毒理學(xué)委員會(huì)第5次全國(guó)會(huì)員代表大會(huì)會(huì)議論文集[C];2017年

5 國(guó)政;陸子音;衣美雙;王劍;謝道遠(yuǎn);陳雪平;李繼昌;;紅景天苷對(duì)黏菌素致雪旺細(xì)胞損傷的保護(hù)作用[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)獸醫(yī)藥理毒理學(xué)分會(huì)第十一屆會(huì)員代表大會(huì)暨第十三次學(xué)術(shù)討論會(huì)與中國(guó)毒理學(xué)會(huì)獸醫(yī)毒理專業(yè)委員會(huì)第五次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2015年

6 代重山;李繼昌;李健;;硫酸黏菌素毒性及其殘留檢測(cè)研究進(jìn)展[A];中國(guó)毒理學(xué)會(huì)獸醫(yī)毒理學(xué)與飼料毒理學(xué)學(xué)術(shù)討論會(huì)暨獸醫(yī)毒理專業(yè)委員會(huì)第4次全國(guó)代表大會(huì)會(huì)議論文集[C];2012年

7 代重山;李繼昌;;黏菌素對(duì)小鼠坐骨神經(jīng)抗氧化功能及超微結(jié)構(gòu)的影響[A];中國(guó)毒理學(xué)會(huì)獸醫(yī)毒理學(xué)與飼料毒理學(xué)學(xué)術(shù)討論會(huì)暨獸醫(yī)毒理專業(yè)委員會(huì)第4次全國(guó)代表大會(huì)會(huì)議論文集[C];2012年

8 代重山;李繼昌;李健;;硫酸黏菌素對(duì)小鼠坐骨神經(jīng)電生理參數(shù)及髓鞘超微結(jié)構(gòu)的影響[A];中國(guó)毒理學(xué)會(huì)獸醫(yī)毒理學(xué)與飼料毒理學(xué)學(xué)術(shù)討論會(huì)暨獸醫(yī)毒理專業(yè)委員會(huì)第4次全國(guó)代表大會(huì)會(huì)議論文集[C];2012年

9 劉宏偉;高延玲;班付國(guó);張發(fā)旺;周紅霞;;微生物濁度法在獸用抗生素效價(jià)測(cè)定中的應(yīng)用研究[A];首屆中國(guó)獸藥大會(huì)動(dòng)物藥品學(xué)暨中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)動(dòng)物藥品學(xué)分會(huì)2008學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2008年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前1條

1 晨曦;硫酸黏菌素被中國(guó)獸藥典委員會(huì)“除名”[N];中國(guó)畜牧獸醫(yī)報(bào);2016年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 林巍;硫酸黏菌素致小鼠神經(jīng)毒性初探及其毒代動(dòng)力學(xué)研究[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前3條

1 王玲;硫酸黏菌素單克隆抗體的研制及ELISA檢測(cè)方法的建立[D];揚(yáng)州大學(xué);2019年

2 卜艷玲;腸桿菌肽體外抑菌作用及在斷奶仔豬生產(chǎn)中應(yīng)用研究[D];沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué);2018年

3 丁文健;硫酸黏菌素誘導(dǎo)小鼠坐骨神經(jīng)自噬的研究[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

本文編號(hào)：2633567