【摘要】：牦牛作為青藏高原地區(qū)重要經(jīng)濟(jì)物種資源,其生存環(huán)境長(zhǎng)期受到高海拔及寒冷因素的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。牦牛是季節(jié)性發(fā)情動(dòng)物,繁殖能力低下,一般是兩年一胎或者是三年兩胎。所以牦牛受精卵對(duì)于牦牛來說非常珍貴,提高受精卵的附植率是提高牦牛生殖率的重要方式。為了提高牦牛胚胎的附植率,本研究對(duì)激素-生長(zhǎng)因子-黏附因子調(diào)節(jié)系統(tǒng)在牦牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞上的變化進(jìn)行研究。主要從以下幾個(gè)方面的試驗(yàn)進(jìn)行:(1)牦牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的分離與培養(yǎng):選取牦牛子宮角后2/3段,并分離出上皮層,利用不同消化方法(胰蛋白酶消化法、Ⅰ型膠原酶消化法、兩部酶消化法)對(duì)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞進(jìn)行消化,利用細(xì)胞MTT測(cè)試計(jì)算細(xì)胞消化數(shù)量及消化率,評(píng)價(jià)最佳消化方法。利用差速消化法和差速貼壁法對(duì)細(xì)胞純化,并評(píng)價(jià)出最佳純化方法。結(jié)果顯示,兩部酶消化法的消化率最高,最佳消化方式為先用0.25%胰蛋白酶消化10min,再用0.25%Ⅰ型膠原酶消化3h。細(xì)胞純化試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),差速貼壁法貼壁30min到35min得到的細(xì)胞純度最高。該試驗(yàn)優(yōu)化了子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的分離及純化,并且得到了高純度的牦牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞。(2)牦牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的鑒定與特性研究:采用純化后第三代牦牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞,利用細(xì)胞計(jì)數(shù)法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線;利用角蛋白18、波形蛋白、PBS對(duì)細(xì)胞進(jìn)行免疫組化鑒定;利用福爾根染色對(duì)細(xì)胞核DNA原位定位;利用秋水仙素法制備染色體并進(jìn)行核型分析。結(jié)果顯示,細(xì)胞生長(zhǎng)曲線類似于“S”型生長(zhǎng)曲線,在3-6天細(xì)胞數(shù)目成對(duì)數(shù)性生長(zhǎng),平均生長(zhǎng)周期為1.5-2天;角蛋白18及波形蛋白表達(dá)為陽(yáng)性、PBS表達(dá)為陰性,且角蛋白18的陽(yáng)性表達(dá)率超過99%,證明細(xì)胞的純度非常高;核型分析得到牦牛共30對(duì)染色體,其中有29對(duì)為長(zhǎng)染色體,一對(duì)為性染色體。這些足以證明通過試驗(yàn)一中得到的細(xì)胞為牦牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞。(3)不同濃度的E_2和P_4對(duì)牦牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞分泌EGF和IGF-1的影響:采用純化后第三代牦牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞,向其中分別添加E_2和P_4兩種激素以及混合添加兩種激素,作用不同時(shí)間后,利用細(xì)胞MTT測(cè)試和Real-time PCR兩種方法檢測(cè)兩種激素對(duì)于細(xì)胞最佳誘導(dǎo)時(shí)間及EGF和IGF-1的最佳表達(dá)時(shí)間;并向其中分別添加不同濃度的E_2和P_4兩種激素以及混合添加不同濃度的兩種激素作用最佳誘導(dǎo)時(shí)間后,利用間接免疫熒光技術(shù)、Real-time PCR、Western-blotting以及ELISA四種方法,檢測(cè)兩種激素對(duì)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞表達(dá)EGF和IGF-1的最佳誘導(dǎo)濃度。結(jié)果顯示,不同種類激素誘導(dǎo)細(xì)胞最佳生長(zhǎng)時(shí)間以及生長(zhǎng)因子最佳表達(dá)時(shí)間均為24h,間接免疫熒光技術(shù)、Real-time PCR、Western-blotting以及ELISA四種方法均證明兩種生長(zhǎng)因子在單一激素誘導(dǎo)下表達(dá)量與激素濃度呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系,但并不顯著,在兩種激素同時(shí)作用下表達(dá)量顯著上升,其中最佳表達(dá)濃度為E_210ng/mL和P_410ng/mL。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)孕酮和雌二醇聯(lián)合作用時(shí)會(huì)有效提高子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞EGF和IGF-1的表達(dá)量。(4)不同濃度的EGF和IGF-1對(duì)牦牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞分泌MUC1和PGF的影響:采用純化后第三代牦牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞,向其中分別添加EGF和IGF-1及其各自受體抑制劑作用不同時(shí)間,利用細(xì)胞MTT測(cè)試和Real-time PCR兩種方法檢測(cè)兩種生長(zhǎng)因子對(duì)細(xì)胞最佳誘導(dǎo)生長(zhǎng)時(shí)間及MUC1和PGF的最佳表達(dá)時(shí)間;向其中分別添加不同濃度的EGF和IGF-1及各自受體抑制劑作用最佳表達(dá)時(shí)間,利用間接免疫熒光技術(shù)、Real-time PCR、Western-blotting三種方法,檢測(cè)EGF和IGF-1對(duì)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞表達(dá)MUC1和PGF的最佳誘導(dǎo)濃度。結(jié)果表明,細(xì)胞最佳生長(zhǎng)時(shí)間以及黏附因子最佳表達(dá)時(shí)間均為24h,間接免疫熒光技術(shù)、Real-time PCR、Western-blotting三種方法均證明MUC1表達(dá)量與EGF和IGF-1的濃度呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系,在濃度為100ng/mL時(shí)表達(dá)量最低,與生長(zhǎng)因子受體抑制劑濃度呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系,最佳濃度為40μΜ/mL;PGF表達(dá)量與EGF和IGF-1的濃度呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系,最佳濃度為100ng/mL,與兩種生長(zhǎng)因子受體抑制劑濃度呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系,在40μΜ/mL時(shí)表達(dá)量最低。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),生長(zhǎng)因子可以抑制子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞上MUC1的表達(dá)但是可以促進(jìn)PGF的表達(dá)。本試驗(yàn)從分離純化培養(yǎng)的牦牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞上對(duì)激素-生長(zhǎng)因子-黏附因子調(diào)節(jié)系統(tǒng)進(jìn)行研究,并闡明E_2及P_4與EGF和IGF-1與MUC1和PGF之間的表達(dá)量誘導(dǎo)關(guān)系。具體結(jié)論如下:1、牦牛子宮內(nèi)膜上皮最佳消化方法是兩步酶消化法,先用0.25%胰蛋白酶消化10min,再用0.25%Ⅰ型膠原酶消化3h。最佳純化方法是差速貼壁法貼壁30min。2、通過免疫組化、福爾根染色和核型分析法證明消化純化得到的細(xì)胞是牦牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞,并繪制該細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。3、單獨(dú)使用E_2和P_4都能促進(jìn)EGF和IGF-1表達(dá),聯(lián)合使用E_2和P_4時(shí),EGF和IGF-1的表達(dá)量顯著升高,其中最佳作用濃度E_2為10ng/mL和P_4為10ng/mL聯(lián)合作用。4、EGF和IGF-1都抑制MUC1的表達(dá),最佳抑制濃度為100ng/mL。其受體抑制劑Gefitinib和BMS-536924都能促進(jìn)MUC1的表達(dá),最佳促進(jìn)濃度為40μM/mL。EGF和IGF-1都能促進(jìn)PGF的表達(dá),最佳促進(jìn)濃度為100ng/mL。其受體抑制劑Gefitinib和BMS-536924都能抑制PGF的表達(dá),最佳抑制濃度為40μM/mL。
【圖文】：

5圖 1：未附植前胚胎的結(jié)構(gòu)Fig.1. The structure of the pre-implantation embryo也是整個(gè)胚胎中最核心的部分。受精卵攜帶了來自于父體的單染色體，通過多次二分裂，是由最初的單細(xì)胞發(fā)展為了多細(xì)胞胞團(tuán)就是這些細(xì)胞的遺傳物質(zhì)。這些內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中的細(xì)胞，在發(fā)來的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)一步進(jìn)行分化，從而形成了胎兒的各個(gè)不同功為胚胎的內(nèi)胚層[36]；②是透明帶：透明帶并不是受精卵時(shí)細(xì)胞形成桑椹胚后，逐漸出現(xiàn)的一個(gè)結(jié)構(gòu)，主要起到的作用時(shí)保護(hù)狀的物質(zhì)，但并不是有磷脂雙分子層所組成的，能夠不阻礙細(xì)有效的低檔有害物質(zhì)對(duì)胚胎的侵害，在胚胎附植的過程中會(huì)脫]；③是滋養(yǎng)層細(xì)胞：哺乳動(dòng)物圍繞胚泡形成的胚外層上皮。將織共同組成胎盤。滋養(yǎng)層是胚胎進(jìn)行附植的最重要的一個(gè)結(jié)構(gòu)與子宮內(nèi)膜上皮之間發(fā)生了緊密的聯(lián)合，從而使得胚胎發(fā)生附著胚胎的發(fā)育，成為了包裹胚胎外胚層的上皮[38]；④是囊胚腔后，細(xì)胞繼續(xù)分裂，到達(dá)桑椹胚，但是在這一過程中，，細(xì)胞向

體[44]。這一過程如圖 2 所示，最后能夠獲得圖 2B 中的精子，即為具有受精能子[45]。在精子的形狀中，精子尾巴主要為了能夠在雌性體內(nèi)更加快速的運(yùn)動(dòng)更有利于精子的運(yùn)動(dòng)發(fā)生，其中頂體主要是保護(hù)精子中的遺傳物質(zhì)，并且也是卵子的重要結(jié)構(gòu)[46]。AB
【學(xué)位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S823.85

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3 徐U

本文編號(hào)：2633569