【摘要】：寄生線蟲不僅給養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失,而且還可以感染人,嚴(yán)重影響人類的健康。WHO組織評(píng)估全球有超過(guò)10億人口感染寄生線蟲,在傷殘調(diào)整生命年中,寄生線蟲的影響超過(guò)了糖尿病和肺癌患者。大規(guī)模和長(zhǎng)期抗寄生蟲藥物的使用已經(jīng)誘導(dǎo)出寄生蟲抗藥性的產(chǎn)生,因此新藥的開發(fā)迫在眉睫,而新型抗寄生線蟲藥物以及疫苗的研發(fā)需要對(duì)寄生線蟲發(fā)育過(guò)程中關(guān)鍵基因的功能進(jìn)行深入研究。蛋白激酶在寄生線蟲發(fā)育生物學(xué)和生殖發(fā)育學(xué)等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用,以蛋白激酶作為藥物靶標(biāo)治療疾病的研究已有報(bào)道,但在寄生線蟲中的研究還寥寥無(wú)幾。RIOK-2蛋白激酶是一種新發(fā)現(xiàn)的非典型蛋白激酶,在酵母和人細(xì)胞核糖體生物合成、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。盡管如此,該分子在線蟲中的功能還所知甚少。本項(xiàng)目選取人獸共患寄生線蟲糞類圓線蟲(Strongyloides stercoralis)作為研究對(duì)象,從結(jié)構(gòu)和功能兩方面對(duì)糞類圓線蟲RIOK-2蛋白激酶編碼基因Ss-riok-2進(jìn)行了研究;同時(shí)利用模式生物自由生活的秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)的轉(zhuǎn)基因和RNAi技術(shù)研究了Ce-RIOK-2蛋白激酶編碼基因Ce-riok-2的功能。(一)糞類圓線蟲Ss-RIOK-2蛋白激酶編碼基因的結(jié)構(gòu)分析本研究通過(guò)RACE-PCR獲得了Ss-riok-2基因的c DNA序列,其中編碼區(qū)為1572bp,共編碼523個(gè)氨基酸。通過(guò)氨基酸比對(duì)發(fā)現(xiàn)編碼的Ss-RIOK-2蛋白具有保守的功能結(jié)構(gòu)域。利用生物信息學(xué)軟件對(duì)Ss-RIOK-2蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行同源建模,預(yù)測(cè)了Ss-RIOK-2蛋白與ATP、金屬離子結(jié)合的關(guān)鍵活性位點(diǎn),為開發(fā)以RIOK-2蛋白作為潛在的抗寄生蟲藥物靶標(biāo)奠定理論基礎(chǔ)。通過(guò)Genomewalker PCR獲得Ss-riok-2基因的g DNA,其長(zhǎng)度為1620bp,包含一個(gè)48bp的內(nèi)含子。預(yù)測(cè)的Ss-riok-2基因啟動(dòng)子序列全長(zhǎng)1308bp,含有真核生物保守的調(diào)控元件。(二)糞類圓線蟲Ss-RIOK-2蛋白激酶編碼基因的表達(dá)、轉(zhuǎn)錄水平及定位分析體外原核表達(dá)和純化了Ss-RIOK-2融合蛋白,進(jìn)一步的激酶活性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了Ss-RIOK-2蛋白激酶具有自我磷酸化作用。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析,Ss-riok-2基因在蟲體各個(gè)階段都有轉(zhuǎn)錄且在寄生雌蟲中最高。轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)表明Ss-riok-2基因啟動(dòng)子可以驅(qū)動(dòng)gfp基因表達(dá)在F1代幼蟲的腸道組織。(三)秀麗隱桿線蟲Ce-RIOK-2蛋白激酶編碼基因的功能分析預(yù)測(cè)的Ce-riok-2基因啟動(dòng)子序列全長(zhǎng)1269bp,轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)表明Ce-riok-2基因啟動(dòng)子也可以驅(qū)動(dòng)gfp基因表達(dá)在F1代幼蟲的腸道組織。當(dāng)幼蟲進(jìn)入deaur時(shí)期時(shí)表達(dá)減弱。反轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)到Ce-riok-2基因在性腺組織中也有轉(zhuǎn)錄。通過(guò)ds RNA飼喂法干擾Ce-riok-2基因在秀麗隱桿線蟲中的表達(dá),結(jié)果導(dǎo)致Ce-riok-2基因轉(zhuǎn)錄水平下調(diào),同時(shí)引起Ce-vit-2基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)且導(dǎo)致蟲體發(fā)生以下表型變化:1.蟲體的發(fā)育減慢;2.蟲體不育;3.蟲體的陰門突出;4.成蟲的性腺細(xì)胞減少和細(xì)胞大小紊亂。本研究首次研究了寄生線蟲糞類圓線蟲Ss-RIOK-2蛋白激酶編碼基因Ss-riok-2基因的結(jié)構(gòu)和功能,并驗(yàn)證了自由生活線蟲秀麗隱桿線蟲Ce-RIOK-2蛋白激酶的功能。以上結(jié)果為進(jìn)一步闡明RIOK蛋白激酶在秀麗隱桿線蟲、糞類圓線蟲及相關(guān)寄生線蟲生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的分子生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

是 1876 年 Normand 從一名患有腹瀉疾病的996)。糞類圓線蟲屬于桿形目(Rhabditata)、類圓ides) 線蟲(林海和楊光友 2016)。糞類圓線蟲的，自由生活雌蟲的體長(zhǎng)約 900-1700 μm，寄生rove 1996, 牟海燕等 2001)。糞類圓線蟲可以寄的小腸粘膜內(nèi)引起糞類圓線蟲病，嚴(yán)重者會(huì)導(dǎo)為“被忽視的熱帶病”(Olsen et al 2009)，尤其染，導(dǎo)致糞類圓線蟲大量繁殖，嚴(yán)重危害人類蟲的生活史trongyloides stercoralis)的生活史較其他寄生線蟲生活史，包括宿主體內(nèi)的寄生循環(huán)(the Parasitthe Free-living cycle)。寄生生活中只有雌蟲，自

圖 1-3 我國(guó)糞類圓線蟲的感染病例分布(Wang et al 2013Fig. 1-3 Cumulative cases and distribution of strongyloidiasis in(Wang et al 2013)圓線蟲的發(fā)病機(jī)理及臨床表現(xiàn)線蟲感染是我國(guó)常見的蠕蟲類寄生蟲病之一，主要發(fā)病機(jī)理向小腸移行引起疾病。糞類圓線蟲病可引起胃腸道癥狀,包括，皮膚問(wèn)題包括瘙癢、皮炎和呼吸道癥狀,如咳嗽、呼吸 al 2002, Keiser and Nutman 2004, 李松林 2001)。當(dāng)患者的如患有 T 細(xì)胞淋巴型病毒病、腎臟移植病、艾滋病等惡性類圓線蟲病，往往會(huì)影響多個(gè)宿主器官，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致死亡ing and Weiss 2006, Sarangarajan et al 1997)。慢性無(wú)癥狀類圓感染(Grove 1996)，當(dāng)同時(shí)應(yīng)用免疫抑制治療時(shí)，它又極有重度感染(Keiser et al 2004)。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S852.731

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