新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)為單股負(fù)鏈不分節(jié)段的RNA病毒,由于其基因組較大,約15 kb,直接在全長(zhǎng)基因組中進(jìn)行分子操作存在技術(shù)困難,對(duì)NDV復(fù)制轉(zhuǎn)錄的機(jī)制及相關(guān)蛋白功能的研究會(huì)產(chǎn)生巨大障礙。故采用微型基因組(Minigenome)技術(shù),即用報(bào)告基因替代病毒編碼區(qū),只保留與病毒基因復(fù)制和轉(zhuǎn)錄相關(guān)的基本調(diào)控序列。NDV基因組的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄依賴(lài)于RNP復(fù)合物的NP、P和L三種蛋白,其它的病毒蛋白可能會(huì)與RNP復(fù)合物發(fā)生相互作用,而其是否參與調(diào)控病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄所知甚少。本研究設(shè)計(jì)了四種微型基因組方案,通過(guò)對(duì)不同方案進(jìn)行驗(yàn)證,明確了微型基因組構(gòu)建過(guò)程所需要的序列信息及插入方式,同時(shí)比較了在不同啟動(dòng)子下表達(dá)效率的差異。此外,對(duì)基礎(chǔ)微型基因組平臺(tái)進(jìn)行特殊改造,創(chuàng)建了復(fù)制缺陷型微型基因組,并對(duì)M、V及W蛋白對(duì)病毒復(fù)制與轉(zhuǎn)錄過(guò)程的影響進(jìn)行了初步研究。主要的研究結(jié)果如下:1.四種NDV微型基因組的構(gòu)建。設(shè)計(jì)方案:(1)按照模擬病毒基因組的方式,將報(bào)告基因EGFP反向插入,兩側(cè)分別為5’Trailer與3’Leader的調(diào)控序列,命名為Mini;(2)在Mini基礎(chǔ)上,缺失相應(yīng)的GE、GS及UTR序列,命名為Mini2;(3)按照構(gòu)建感染性克隆的方式,將EGFP正向插入,兩側(cè)分別為5’Leader與3’Trailer的調(diào)控序列,命名為MG;(4)在MG基礎(chǔ)上,缺失相應(yīng)的GE、GS及UTR序列,命名為MG2。四種微型基因組分別克隆在含T7啟動(dòng)子的pUC19載體中,與NP、P、L及T7 RNA聚合酶表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞分析EGFP的表達(dá),發(fā)現(xiàn)僅Mini具有功能性。結(jié)果表明報(bào)告基因只能反向插入,GE-5’UTR、3’UTR-GS是微型基因組必不可少的基因元件。2.兩種啟動(dòng)子對(duì)微型基因組表達(dá)效率的影響。將Mini微型基因組分別克隆到含T7啟動(dòng)子與雞β-actin啟動(dòng)子的載體中,分別為pUC19-Mini-EGFP與pCAGGS-Mini-EGFP。通過(guò)對(duì)表達(dá)效率的分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)T7啟動(dòng)子遠(yuǎn)高于雞β-actin啟動(dòng)子。3.復(fù)制缺陷型微型基因組的構(gòu)建。為了獨(dú)立研究病毒的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄兩個(gè)過(guò)程,將微型基因組5’端Trailer序列缺失,導(dǎo)致病毒基因組(vRNA)復(fù)制產(chǎn)生3’端缺失Trailer(ΔT)的cRNA,ΔT cRNA將不能啟動(dòng)復(fù)制產(chǎn)生vRNA,以此可以區(qū)分基因的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄過(guò)程,命名為pUC19-Mini-ΔT。4.M、V和W蛋白對(duì)病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄調(diào)控的作用。為了定量報(bào)分析報(bào)告基因的表達(dá),在正常(復(fù)制敏感型)與復(fù)制缺陷型的兩種微型基因組中采用螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因,分別命名為pUC19-Mini-Lu和pUC19-Mini-ΔT-Luc。將M、V和W表達(dá)質(zhì)粒與兩個(gè)系統(tǒng)分別共轉(zhuǎn)染細(xì)胞,分析螢火蟲(chóng)熒光素酶活性,結(jié)果顯示僅V蛋白對(duì)病毒基因組的轉(zhuǎn)錄有抑制的作用,而M和W蛋白沒(méi)有影響。綜上所述,明確了微型基因組的構(gòu)建方式,并對(duì)微型基因組的表達(dá)進(jìn)行了的優(yōu)化。同時(shí)利用正常與復(fù)制缺陷型的兩種微型基因組,確定了V蛋白對(duì)病毒的轉(zhuǎn)錄有影響。本研究為了解NDV基因組的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄及相關(guān)蛋白的作用奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：S852.65
文章目錄
摘要
ABSTRACT
文獻(xiàn)綜述
第一章 新城疫病毒及微型基因組系統(tǒng)的研究進(jìn)展
1.1 新城疫病毒概述
1.1.1 NDV的分子結(jié)構(gòu)及蛋白功能
1.1.2 NDV復(fù)制與轉(zhuǎn)錄的過(guò)程
1.2 M、V及W蛋白對(duì)病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的調(diào)控
1.3 NDV的微型基因組
1.3.1 微型基因組
1.3.2 微型基因組的構(gòu)造
1.3.3 微型基因組的表達(dá)
1.3.4 微型基因組的應(yīng)用
試驗(yàn)研究
第二章 新城疫病毒微型基因組的構(gòu)建
2.1 材料
2.1.1 細(xì)胞、載體及毒株
2.1.2 主要試劑、主要儀器及常用試劑的配制
2.2 方法
2.2.1 不含報(bào)告基因微型基因組的合成
2.2.2 引物的設(shè)計(jì)及合成
2.2.3 質(zhì)粒的構(gòu)建
2.2.4 病毒總RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄
2.2.5 Western Blot
2.2.6 熒光蛋白的觀察
2.3 結(jié)果
2.3.1 微型基因組的設(shè)計(jì)
2.3.2 微型基因組質(zhì)粒的構(gòu)建
2.3.3 不同啟動(dòng)子微型基因組質(zhì)粒的構(gòu)建
2.3.4 輔助質(zhì)粒的構(gòu)建
2.3.5 表達(dá)T7 RNA聚合酶質(zhì)粒的構(gòu)建及驗(yàn)證
2.3.6 微型基因組功能的分析
2.4 討論
2.5 小結(jié)
第三章 利用微型基因組系統(tǒng)研究M、V及W蛋白對(duì)NDV復(fù)轉(zhuǎn)與轉(zhuǎn)錄調(diào)控的作用
3.1 材料
3.1.1 細(xì)胞及載體
3.1.2 主要試劑、主要儀器及常用試劑的配制
3.2 方法
3.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成
3.2.2 質(zhì)粒的構(gòu)建
3.2.3 熒光素酶的測(cè)定
3.3 結(jié)果
3.3.1 含熒光素酶報(bào)告基因微型基因組的構(gòu)建
3.3.2 復(fù)制缺陷型微型基因組質(zhì)粒的構(gòu)建
3.3.3 M、V及W蛋白對(duì)病毒復(fù)制與轉(zhuǎn)錄的影響
3.4 討論
3.5 小結(jié)
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝
作者簡(jiǎn)介
【相似文獻(xiàn)】
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本文編號(hào)：
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