【摘要】：干擾素誘導(dǎo)蛋白204(IFI204)是一種胞內(nèi)DNA受體,能夠識別DNA病毒和胞內(nèi)菌。目前已知IFI204識別DNA后主要啟動兩種天然免疫信號:誘導(dǎo)干擾素產(chǎn)生和引起炎性體活化。腸炎和腸癌等腸道疾病是嚴(yán)重威脅人類以及多種動物健康的重要疾病之一,IFI204在腸道疾病中的作用仍不清楚。本論文以葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎為研究模型,探討IFI204對腸炎發(fā)生的調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)IFI204主要通過調(diào)節(jié)腸道菌群的構(gòu)成發(fā)揮抗結(jié)腸炎的作用,并分析疣微菌門疣微菌屬Akkermansia muciniphilia(A.muciniphilia)對結(jié)腸炎發(fā)生具有保護(hù)作用。首先,通過熒光定量PCR的方法對IFI204在小鼠各個組織中的表達(dá)情況進(jìn)行檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)IFI204在小腸、盲腸以及結(jié)腸中均有表達(dá)。隨后,通過DSS誘導(dǎo)腸炎模型,分析IFI204在結(jié)腸炎中的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn),IFI204基因缺失小鼠對DSS誘導(dǎo)的腸炎更為易感。主要表現(xiàn)為:IFI204基因缺失后,小鼠存活率顯著降低;從DSS誘導(dǎo)腸炎的第5天開始,小鼠體重減輕更為明顯;IFI204基因缺失小鼠結(jié)腸組織腸黏膜下層水腫嚴(yán)重,腸黏膜大面積潰瘍,結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重,病理損傷更為嚴(yán)重。通過免疫組化的方法對構(gòu)成黏液層的主要黏蛋白mucin2的表達(dá)情況、黏液層的厚度、分泌黏蛋白的杯狀細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn),空白組的WT小鼠和IFI204基因缺失小鼠mucin2的表達(dá)無明顯差異,黏液層厚度相似,杯狀細(xì)胞數(shù)量相近。通過AB和PAS染色對黏蛋白的表達(dá)量及性質(zhì)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),與WT小鼠相比,IFI204基因缺失小鼠總的黏蛋白表達(dá)量無顯著差異,然而,對維持黏液層穩(wěn)定性起重要作用的酸性黏蛋白顯著減少。以上結(jié)果說明IFI204基因缺失小鼠對DSS誘導(dǎo)腸炎易感性增加,且對腸炎易感性增加可能源于酸性黏蛋白表達(dá)減少所致。黏蛋白能夠被腸道微生物降解,并為微生物的成長提供能量,影響微生物的組成,同時腸道微生物菌群也能夠影響?zhàn)さ鞍椎谋磉_(dá)及性質(zhì)。因此,我們進(jìn)一步分析IFI204對黏蛋白性質(zhì)的影響,以及對腸炎易感性的差異是否由腸道微生物調(diào)節(jié)。對兩種基因型小鼠糞便基因組DNA進(jìn)行16srRNA測序分析發(fā)現(xiàn),兩種基因型小鼠菌群不同,分別位于不同的群落內(nèi)。厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門細(xì)菌總共占整個腸道微生物菌群的98%以上。對這三個門的細(xì)菌進(jìn)行PCR分析統(tǒng)計發(fā)現(xiàn),與WT小鼠相比,IFI204基因缺失小鼠腸道微生物中擬桿菌門和變形菌門存在顯著差異,而厚壁菌門無明顯差異。為了驗證WT與IFI204~(-/-)小鼠之間的差異是否由腸道菌群的改變引起的,將兩種基因型的小鼠共同飼養(yǎng)或交叉撫育,使腸道菌群趨于一致。然后通過DSS誘導(dǎo)腸炎,分析菌群差異是否影響IFI204基因缺失小鼠對腸炎的易感性。結(jié)果發(fā)現(xiàn),共同飼養(yǎng)或交叉撫育后的兩種基因型小鼠對DSS誘導(dǎo)腸炎的易感性趨于一致。主要體現(xiàn)在DSS誘導(dǎo)腸炎后,共同飼養(yǎng)或交叉撫育后的兩種基因型小鼠存活率一致,體重減輕一致,臨床病理學(xué)評分一致;DSS誘導(dǎo)腸炎第7天,結(jié)腸組織病理損傷無明顯差異,病理損傷評分一致。此外,在共同飼養(yǎng)或交叉撫育后的兩種基因型小鼠mucin2黏蛋白的表達(dá)、總黏蛋白的表達(dá)仍然沒有差異,而酸性黏蛋白的表達(dá)則趨于一致。由以上結(jié)果可知,IFI204基因缺失小鼠對DSS誘導(dǎo)腸炎易感性增加以及酸性黏蛋白的減少是由腸道微生物菌群所介導(dǎo)的,且微生物所介導(dǎo)的腸炎易感性可以轉(zhuǎn)移。IFI204基因缺失小鼠具有不同于WT小鼠的微生物菌群,對糞便細(xì)菌DNA進(jìn)行16srRNA比對分析尋找關(guān)鍵的差異菌群,結(jié)果發(fā)現(xiàn)IFI204基因缺失后差異最大的是疣微菌門疣微菌屬A.muciniphilia,其含量顯著增加。通過熒光定量PCR的方法對共同飼養(yǎng)或交叉撫育后的兩種基因型小鼠中A.muciniphilia的含量進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn),共同飼養(yǎng)或交叉撫育后的兩種基因型小鼠糞便DNA中A.muciniphilia的含量趨于一致,表明A.muciniphilia能夠轉(zhuǎn)移�；谝陨辖Y(jié)果我們推測A.muciniphilia可能作為關(guān)鍵差異菌決定IFI204基因缺失小鼠對DSS誘導(dǎo)腸炎易感性。因此,我們采用厭氧培養(yǎng)方式,從IFI204基因缺失小鼠糞便中對A.muciniphilia進(jìn)行分離和純化。成功得到分離株后,通過灌胃的方式將A.muciniphilia回補(bǔ)到WT小鼠體內(nèi),分析該菌對腸炎易感性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)回補(bǔ)A.muciniphilia能夠在腸道定植,且能夠顯著提高小鼠存活率。綜上所述,本論文研究結(jié)果表明IFI204能調(diào)節(jié)腸道微生物菌群,進(jìn)而抑制DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎發(fā)生。腸道菌群A.muciniphilia可能介導(dǎo)小鼠對DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎的保護(hù)作用。
【圖文】：

圖 1.1 小鼠各組織器官中 IFI204 基因的表達(dá)ig.1.1 The expression of IFI204 in different tussions 發(fā)生結(jié)腸炎后存活和體重的變化以及臨床鼠和 IFI204-/-小鼠各 7 只，2% DSS 溶液誘導(dǎo)結(jié)小鼠的精神狀態(tài)及是否出現(xiàn)臨床病理現(xiàn)象，統(tǒng)計 圖所示，IFI204-/-小鼠自第 8 天開始死亡，第 11 0 天開始死亡，統(tǒng)計到第 15 天存活率為 28%左右逐漸恢復(fù)正常，統(tǒng)計學(xué)分析存活曲線，兩組小鼠對兩種基因型小鼠的體重變化進(jìn)行統(tǒng)計，結(jié)果如重持續(xù)急劇地下降，，WT 小鼠體重下降較 IFI20小鼠體重在第 5-9 天均有顯著差異。根據(jù)小鼠的腸的顏色進(jìn)行臨床病理評分，發(fā)現(xiàn) IFI204-/-小鼠

圖 1.3 結(jié)腸組織病理切片（Fig.1.3 Histopathological change(A)aA．DSS 誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎第 7 天，結(jié)腸組織A. H&E staining of mouse colon tissue on d*P<1.2.4 小鼠結(jié)腸組織黏蛋白的檢測在腸道組織中，mucin2 黏蛋白是構(gòu)免疫組化檢測了小鼠結(jié)腸組織 mucin2 的腸杯狀細(xì)胞的數(shù)量。如圖 1.4 所示，圖 及厚度，WT 小鼠與 IFI204-/-小鼠 NT 組C 為 WT 與 IFI204-/-小鼠結(jié)腸杯狀細(xì)胞鼠由于結(jié)腸炎組織結(jié)構(gòu)遭到嚴(yán)重破壞，其通過 PAS 和 AB 染色檢測結(jié)腸組織不同
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S856.4

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2632509