【摘要】：子宮是奶牛生殖系統(tǒng)重要的組成部分,是胚胎附植及發(fā)育的主要場所,其生理結(jié)構(gòu)與功能的完整性直接關(guān)系到奶牛的生產(chǎn)繁殖。奶牛產(chǎn)后因子宮頸松弛,子宮內(nèi)膜上皮受損,易導(dǎo)致子宮感染,造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。引起產(chǎn)后子宮內(nèi)感染的主要是大腸桿菌,其主要通過脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)發(fā)揮致病作用。甲硫腦啡肽(Met-enkephalin,MENK)是哺乳動物體內(nèi)天然生成的具有阿片樣作用的多肽,MENK及其受體已被證實(shí)存在于子宮內(nèi)膜中。有研究表明,MENK可抑制子宮細(xì)胞增殖,但MENK對奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞(BEEC)增殖的作用尚無研究。本試驗(yàn)以BEEC為研究對象,探究在LPS作用下,MENK對細(xì)胞增殖活性、細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖相關(guān)因子和信號通路的影響。試驗(yàn)一研究MENK對LPS作用下BEEC的增殖影響機(jī)制,分為空白組、LPS組(1μg/mL),以及LPS(1 μg/mL)與不同濃度MENK共處理組。試驗(yàn)二進(jìn)一步利用MENK拮抗劑納洛酮(Naloxone,NAL),驗(yàn)證MENK對細(xì)胞增殖變化的影響,分為空白組、LPS組(1 μg/mL),以及LPS(1 μμg/mL)、不同濃度MENK與NAL共處理組。采用CCK-8法檢測細(xì)胞活力變化;采用流氏細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期變化;采用熒光定量PCR檢測細(xì)胞增殖相關(guān)因子的基因表達(dá);采用Western blot檢測細(xì)胞增殖相關(guān)通路的變化。根據(jù)試驗(yàn)一分組處理BEEC 24 h后,LPS處理組細(xì)胞增殖活性高于空白組(p0.01);與LPS處理組相比,LPS與MENK(10-6～10-4mol/L)共處理組細(xì)胞增殖活性降低(p0.01);MENK單獨(dú)處理(10-9～10-4mol/L)不影響細(xì)胞增殖活性(p0.05)。與空白組相比,LPS處理組G1期細(xì)胞數(shù)量極顯著降低(p0.01),S期細(xì)胞數(shù)量極顯著升高(p0.01),PI極顯著升高(p0.01);與LPS處理組相比,LPS和MENK(10-6～10-5mol/L)共處理組G1期細(xì)胞數(shù)量極顯著升高(p0.01),PI極顯著降低(p0.01)。與空白組相比,LPS處理組在3 h、6 h和12 h細(xì)胞EGFR、VEGF、FGF-2和TGF-β3基因表達(dá)量均升高(p0.05);與LPS處理組相比,LPS和MENK(10-6～10-5mol/L)共處理組細(xì)胞在6 h和12 h時EGFR、VEGF和FGF-2基因表達(dá)量下降(p0.05),TGF-β3基因表達(dá)量無顯著差異(p0.05)。與空白對照組相比,LPS處理組在30 min時β-catenin、c-Myc、Cyclin D1的蛋白表達(dá),以及PI3K和Akt的磷酸化水平均升高(p0.05);與LPS處理組相比,LPS和MENK(10-7～10-5mol/L)共處理組β-catenin和c-Myc蛋白表達(dá)量下降(p0.01),LPS和MENK(10-6～10-5 mol/L)共處理組Cyclin D1蛋白表達(dá)量降低(p0.05),細(xì)胞PI3K磷酸化水平在LPS與10-6 mol/L～10-5 mol/L MENK共處理下降低(p0.05),Akt磷酸化水平在LPS與 10-5 mol/L MENK共處理下降低(p0.05)。以上結(jié)果表明,LPS可促進(jìn)BEEC細(xì)胞的增殖活性和細(xì)胞周期進(jìn)程,上調(diào)EGFR、VEGF和FGF-2基因的表達(dá),誘導(dǎo)細(xì)胞Wnt/β-catenin和PI3K/Akt通路的激活,MNEK可抑制LPS誘導(dǎo)的BEEC細(xì)胞的增殖。根據(jù)試驗(yàn)二分組處理BEEC 24 h后,LPS處理組細(xì)胞增殖活性極高于空白組(p0.01);與LPS處理組相比,LPS、MENK(10-4mol/L)和NAL(10-4mol/L)共處理組細(xì)胞增殖活性降低(p0.01);10-9～10-5mol/LNAL單獨(dú)處理BEEC不影響細(xì)胞增殖活性(p0.05)。與空白組相比,LPS處理組G1期細(xì)胞數(shù)量極顯著降低(p0.01),S期細(xì)胞數(shù)量極顯著升高(p0.01),PI極顯著升高(p0.01);與LPS處理組相比,LPS、MENK和NAL共處理組各期細(xì)胞數(shù)量無顯著變化(p0.05),PI無顯著差異(p0.05)。與空白組相比,LPS處理組細(xì)胞EGFR、VEGF、FGF-2和TGF-β3基因表達(dá)量在6h顯著升高(p0.05);與LPS處理組相比,LPS、MENK(10-8mol/L～10-5mol/L)和NAL(10-8mol/L～10-5mol/L)共處理組EGFR、VEGF、TGF-β3和FGF-2基因表達(dá)量無顯著差異(p0.05)。與空白對照組相比,LPS處理組30min時β-catenin、c-Myc和Cyclin D1的蛋白表達(dá),以及PI3K和Akt的磷酸化水平量均升高(p0.05);與LPS處理組相比,LPS、MENK(10-8mol/L～10-5mol/L)和NAL(10-8mol/L～10-5mol/L)共處理組β-catenin、c-Myc和Cyclin D1的蛋白表達(dá)量,以及PI3K和Akt的磷酸化水平無顯著差異(p0.05)。這些結(jié)果提示MNEK可抑制LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖活性和Wnt/β-catenin及PI3K/Akt通路的激活,下調(diào)EGFR、VEGF和FGF-2基因的表達(dá),且這種抑制作用可被NAL所阻斷。綜上,MNEK可抑制LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期進(jìn)程,下調(diào)增殖相關(guān)因子EGFR、VEGF和FGF-2的表達(dá),抑制增殖信號通路Wnt/β-catenin和PI3K/Akt的激活,且這種抑制作用可被NAL所阻斷,表明MENK可能通過阿片受體介導(dǎo)參與對LPS誘導(dǎo)的BEEC細(xì)胞增殖抑制作用。
【圖文】：

ｇｒｏｕｐ．逡逑３．２細(xì)胞周期變化逡逑如圖２－２所示，與空白組相比，ＬＰＳ處理組Ｇ１期細(xì)胞數(shù)量極顯著降低（ｐ＜０．０１），邋Ｓ逡逑期細(xì)胞數(shù)量極顯著升高（Ｐ＜０．０１），邋ＰＩ極顯著升高（／？＜0．0１）；與ＬＰＳ處理組相比，ＬＰＳ逡逑（ｌｐｇ／ｍＬ）、ＭＥＮＫ和ＮＡＬ共處理組處于各期細(xì)胞數(shù)量無顯著變化（ｐ＞０．０５）。逡逑

邐Ｔ？ｕ逡逑ＬＰＳ邋（邋“ｌｇ，，ｍＬ邋）邋＋ＭＥｉ５ｉＴ（Ｔ0＊５ｍｏＩ／Ｌ）＋ＮＡＬ（１０＊％ｌｏｌ／Ｌ）逡逑圖２－２邋ＮＡＬ對ＢＥＥＣ細(xì)胞周期的影響逡逑注：與空白組相比，“＊’＞＜０．０５，邋‘‘＊＊＞＜０．０１；與邋ＬＰＳ邋單獨(dú)處理組相比，“�！荆迹埃埃�，邋“＃＃’＞＜０．０１逡逑Ｆｉｇ邋１－２邋Ｔｈｅ邋ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ＮＡＬ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ｃｅｌｌ邋ｃｙｃｌｅ邋ｏｆ邋ＢＥＥＣ逡逑Ｎｏｔｅ：邐０５，邋“＊＊’’／？＜０．０１，邋ｃｏｍｐａｒｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋ｇｒｏｕｐ；“�！�？＜０．０５，邐１，ｃｏｍｐａｒｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ＬＰＳ逡逑ｇｒｏｕｐ邋．逡逑３．３細(xì)胞增殖相關(guān)因子的基因表達(dá)變化逡逑ＮＡＬ對ＢＥＥＣ細(xì)胞增殖相關(guān)因子基因表達(dá)的影響如圖２－３所示，與空白組相比，ＬＰＳ處逡逑理組ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ－２和ＴＧＦ－ｐ３基因的表達(dá)均顯著升高（／；＜０．０５）；與ＬＰＳ處理組相逡逑比
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S858.23

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本文編號：2628869