【摘要】：夏季高溫環(huán)境對(duì)全球奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成損失,而成為乳品行業(yè)嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。荷斯坦奶牛具有奶牛產(chǎn)量高耐熱性差的特點(diǎn),而娟珊牛耐熱性好,如果通過娟姍牛改良荷斯坦進(jìn)一步選育優(yōu)良雜交對(duì)于應(yīng)對(duì)未來全球變暖具有重要意義,因此,本研究通過對(duì)娟珊牛適應(yīng)南方夏季生理生化反應(yīng)和基因調(diào)控機(jī)制,旨在進(jìn)一步挖掘娟珊牛耐熱候選基因。本研究采用娟姍牛為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(n=10,340±40 kg,3.5±0.3 year),通過生理、生化、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和蛋白表達(dá)四個(gè)試驗(yàn)進(jìn)行研究。2018年7~8月,實(shí)驗(yàn)在重慶光大奶牛場(chǎng)完成。通過測(cè)量和分析呼吸率(Respiration rate,RR)、出汗率(Sweating rate,SR)、直腸溫度(Rectal temperature,RT)、有毛皮膚溫度(Skin temperature with hair,ST(hair))和無毛皮膚溫度(Skin temperature without hair,ST(no hair))來評(píng)估娟姍牛耐熱性能。在不同的溫度下采集血液樣品,分離出血清和白細(xì)胞。通過Elisa檢測(cè)血清中的腺苷酸活化蛋白激酶(Adenosine monopho sphate activated protein kinase,AMPK)、熱應(yīng)激轉(zhuǎn)錄因子(Heat shock transcription factor,HSF)、瘦素(Leptin)、饑餓素(Ghrelin)、Na~+-K~+-ATP酶。用RNA-seq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)白細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,用Western blot技術(shù)對(duì)相關(guān)蛋白進(jìn)行驗(yàn)證。同時(shí)對(duì)環(huán)境指標(biāo)進(jìn)行測(cè)量,結(jié)果如下:1.氣象數(shù)據(jù)包括干球溫度、濕球溫度、相對(duì)濕度和溫濕度指數(shù)(THI)受不同時(shí)間影響差異顯著(P0.01)。娟姍牛熱反應(yīng)生理指標(biāo)包括RR、SR、ST、ST(hair)和ST(no hair),隨THI增加而顯著增加(P0.01);其反應(yīng)血清指標(biāo)包括AMPK、HSF、Leptin、Ghrelin、Na~+-K~+-ATP酶,隨THI增加而顯著增加(P0.01)。2.不同溫度梯度(25℃、30℃、35℃)娟姍牛白細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析結(jié)果顯示:(1)以25℃為對(duì)照,30℃時(shí)白細(xì)胞中共檢出170個(gè)差異基因,其中144個(gè)基因上調(diào)表達(dá),26個(gè)基因下調(diào)表達(dá),這些基因被注釋到1306條GO term中;在35℃時(shí)白細(xì)胞中共檢出65個(gè)差異基因,其中58條上調(diào)基因,7條下調(diào)基因,這些基因被注釋到1147條GO term中;(2)以30℃為對(duì)照,在35℃時(shí)白細(xì)胞中共檢出30個(gè)差異基因,其中2個(gè)基因上調(diào)表達(dá),28個(gè)基因下調(diào)表達(dá),這些基因被注釋到371個(gè)GO term中(FC2,P0.01)。根據(jù)1150條熱調(diào)控基因和212條差異表達(dá)基因,篩選出16條熱調(diào)控差異表達(dá)基因。3.轉(zhuǎn)錄組GO功能注釋結(jié)果分析顯示娟珊牛白細(xì)胞熱調(diào)控差異表達(dá)基因功能主要集中在細(xì)胞程序(cellular process)、單組織程序(single-organism process)、生物調(diào)節(jié)(biological regulation)、生物調(diào)節(jié)過程(regulation of biological process)、細(xì)胞(cell)、細(xì)胞區(qū)域(cell part)、細(xì)胞器(organelle)、細(xì)胞膜(membrane)和分子結(jié)合(binding)等20個(gè)功能有關(guān)。KEGG功能注釋結(jié)果分析顯示,娟珊牛白細(xì)胞差異上調(diào)表達(dá)基因功能主要集中在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(Signal transduction)信號(hào)分子與相互作用(Signaling molecules and interaction)、免疫系統(tǒng)(Immune system)和內(nèi)分泌系統(tǒng)(Endocrine system)等功能。這些功能的實(shí)現(xiàn)可能和娟珊牛耐熱性有關(guān)。4.通過轉(zhuǎn)錄組GO和KEGG富集分析,GO和KEGG分別篩選到20條和13條信號(hào)通路。GO富集的信號(hào)通路主要包括磷代謝進(jìn)程的調(diào)控(regulation of phosphorus metabolic process)、氧水平反應(yīng)(response to oxygen levels)、運(yùn)動(dòng)(movement)、細(xì)胞成分的正調(diào)控(positive regulation of cellular component)、氧水平下降的反應(yīng)(response to decrease oxygen levels)、缺氧反應(yīng)(response to hypoxia)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的正調(diào)控(positive regulation of cell motility)、發(fā)育過程的調(diào)節(jié)(regulation of developmental process)、細(xì)胞因子活性(cytokine activity)等。而這些調(diào)控主要又和氧調(diào)控有關(guān)。KEGG富集的信號(hào)通路主要包括AGE-RAGE信號(hào)通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、膀胱癌(Bladder cancer)、VEGF信號(hào)通路(VEGF signaling pathway)、胰腺癌(Pancreatic cancer)、腎細(xì)胞癌(Renal cell carcinoma)、TNF信號(hào)通路(TNF signaling pathway)和HIF-1信號(hào)通路(HIF-1 signaling pathway)等信號(hào)通路。VEGF可以增強(qiáng)血管的通透性,更利于氧等物質(zhì)的交換;在缺氧條件下可以改變細(xì)胞外基質(zhì);引起受體自身的磷酸化,這些功能和GO分析結(jié)果相統(tǒng)一,所對(duì)VEGF信號(hào)通路的研究有意義。5.將篩選到熱調(diào)控差異表達(dá)基因進(jìn)行共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析,共發(fā)現(xiàn)14個(gè)基因具有相關(guān)性,尤其是ENSBTAG00000005339與其他6個(gè)基因具有相關(guān)性,而且該條基因還參與VEGF信號(hào)通路,因此該條基因可能對(duì)娟珊牛適應(yīng)南方夏季高溫氣候發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用,具有重大研究?jī)r(jià)值。6.娟珊牛白細(xì)胞中HSP70分析結(jié)果與篩選的熱調(diào)控差異表達(dá)上調(diào)基因結(jié)果具有一致性。結(jié)論(1)夏季隨著溫度增加,娟姍牛血清耐熱分子和白細(xì)胞中HSP 70表達(dá)增強(qiáng)。相應(yīng)ENSBTAG00000005339、ENSBTAG00000010303、SAMSN1、PRDM1、ENSBTAG00000047561、IL-8、BHLHE40、NR4A2、DUSP6、EDN1、MYL9、PTGS2和DNAJB13等13條熱調(diào)控差異上調(diào)基因表達(dá)增加,可以作為奶牛耐熱品種候選基因。(2)以25℃為對(duì)照,30℃和35℃的上調(diào)基因下調(diào)基因和GO term分別是144和65、26和7、1360和1147;以30℃為對(duì)照,35℃上調(diào)基因、下調(diào)基因和GO term分別是2、28和371(FC2,P0.01)。根據(jù)1550條熱調(diào)控基因和212條差異表達(dá)基因篩選到16條熱調(diào)控基因。(3)GO功能集中在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞程序、細(xì)胞和細(xì)胞區(qū)域等功能。KEGG功能集中在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、信號(hào)分子及其相互作用和免疫系統(tǒng)等功能。這些功能的實(shí)現(xiàn)可能與娟珊牛耐熱性有關(guān)。(4)GO和KEGG富集分析結(jié)果表明熱調(diào)控差異基因在熱應(yīng)激時(shí)發(fā)揮氧調(diào)控功能,所以不同程度的熱應(yīng)激可能導(dǎo)致不同程度的氧代謝。(5)將篩選到熱調(diào)控差異表達(dá)基因進(jìn)行相關(guān)性分析,共發(fā)現(xiàn)14個(gè)基因具有相關(guān)性,尤其是ENSBTAG00000005339與其他6個(gè)基因具有相關(guān)性,而且該條基因還參與VEGF信號(hào)通路,因此該條基因可能對(duì)娟珊牛適應(yīng)南方夏季高溫氣候發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用,具有重大研究?jī)r(jià)值。
【圖文】：

酸粒細(xì)胞和嗜堿粒細(xì)胞三種。僅對(duì)奶牛的生產(chǎn)性能造成影響，還會(huì)造成奶牛各t al.(1998)[117]的研充指出：夏季熱應(yīng)激導(dǎo)致奶牛乳房熱的時(shí)候，隨著溫濕度指數(shù)的升高（Max THI＞8直線上升（圖 1.1）[118]。白細(xì)胞是免疫系統(tǒng)的重要響白細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。蔡亞非（2005）[120]發(fā)現(xiàn) 37值。但又受到氣溫的影響，隨氣溫的下降而升高。另奶牛非熱應(yīng)激組和中度熱應(yīng)激組血液中白細(xì)胞發(fā)現(xiàn)應(yīng)激組白細(xì)胞數(shù)量下降差異極顯著。這說明奶牛于正常水平。巨向紅（2009）[121]研究發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激，嗜中性粒細(xì)胞百分率下降，嗜酸性和嗜堿性粒高。此外有關(guān)對(duì)夏季奶牛發(fā)生熱應(yīng)激時(shí)對(duì)其白細(xì)激時(shí)耐熱品種娟珊牛白細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析意義。

西南大學(xué)碩士學(xué)位論文h 一直平緩增加，而 RR 的變化曲線在 06:00 h～10:00 h 范圍陡峭，在 10:0急劇的變化，而其變化曲線在 10:00 h～16:00 h 變得平緩（圖 4.5a）。毛區(qū)和無毛區(qū)皮膚溫度同時(shí)間娟珊牛 ST（hair）和 ST（no hair）受 THI 影響極顯著（P<0.01）（圖 4.5)（圖 4.3）。隨著 THI 的增加，娟珊牛的 ST(hair)和 ST(no hair)隨之化范圍相應(yīng) ST(hair)為 36.9 ℃～41.7 ℃，，而 ST（no hair）為 36.3 ℃～41.1.3），而且有 ST（hair）高于 ST（no hair）(圖 4.3)。白天時(shí)間變化范圍是 0600 h，隨時(shí)間的變化娟珊牛 ST(hair)和 ST（no hair）隨之增加（圖 5b）。ST（hair）和 ST（no hair）曲線變化從 06:00 h～12:00 h 范圍陡峭，另一hair）和 ST（no hair）變化曲線在 12:00 h～16:00 h 范圍平緩（圖 4.5b）
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S823

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2628840