【摘要】：慶大霉素是一種廣泛應(yīng)用于臨床的氨基糖苷類抗生素,具有較強(qiáng)的抗菌活性和較廣的抗菌譜,若使用不當(dāng)會引起多器官損傷。慶大霉素進(jìn)入機(jī)體會在腎臟中蓄積,從而引起腎損傷。近些年發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡在慶大霉素誘導(dǎo)的腎損傷中有重要作用,但細(xì)胞凋亡作用機(jī)制仍未闡明。MPTP的開放會導(dǎo)致線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換的發(fā)生,進(jìn)而激活線粒體凋亡途徑,但慶大霉素能否誘導(dǎo)MPTP開放尚不清楚。本研究以體外培養(yǎng)MDCK細(xì)胞為模型,通過體外試驗探究MPTP在慶大霉素誘導(dǎo)細(xì)胞線粒體凋亡途徑中的作用機(jī)制以及依達(dá)拉奉在其中的保護(hù)作用。1、慶大霉素對MDCK細(xì)胞毒性的影響為研究慶大霉素對MDCK細(xì)胞的毒性作用,不同濃度(0、2、4、8mmol/L)慶大霉素處理MDCK細(xì)胞24h以及4mmol/L慶大霉素處理MDCK細(xì)胞不同時間(0、6、12、24 h),CCK-8法測定慶大霉素對細(xì)胞存活率的影響,ELISA法檢測KIM-1和NGAL損傷因子的分泌情況,流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞MPTP開放和細(xì)胞凋亡率,Hochest 33258染色觀察細(xì)胞核形態(tài)的變化,免疫印跡法檢測Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)量。結(jié)果顯示,與對照組相比,隨著慶大霉素染毒濃度的增加和時間的延長,MDCK細(xì)胞活力呈下降趨勢(P0.05或P0.01)。隨著慶大霉素染毒濃度的增加,KIM-1和NGAL含量先升高后降低,在慶大霉素為4 mmol/L時達(dá)到分泌的峰值(P0.05或P0.01);隨著慶大霉素染毒時間的延長,KIM-1含量先升高后下降,而NGAL含量呈上升趨勢(P0.05或P0.01)。與對照組相比,隨著慶大霉素染毒濃度的增加和時間的延長,MPTP開放和細(xì)胞凋亡率顯著或極顯著上升(P0.05或P0.01);細(xì)胞核出現(xiàn)固縮、濃染甚至碎裂的現(xiàn)象;Bcl-2/Bax比值顯著或極顯著下降(P0.05或P0.01)。說明慶大霉素對MDCK細(xì)胞有毒性作用,存在劑量-效應(yīng)關(guān)系和時間-效應(yīng)關(guān)系,并且其可以誘導(dǎo)MPTP開放、細(xì)胞凋亡,其毒性機(jī)制可能與MPTP開放、細(xì)胞凋亡有關(guān)。2、MPTP在慶大霉素誘導(dǎo)MDCK細(xì)胞凋亡途徑中的作用為研究MPTP在慶大霉素誘導(dǎo)MDCK細(xì)胞線粒體凋亡中的作用,本試驗用4 mmol/L慶大霉素和2 μmol/L抑制劑CsA單獨或聯(lián)合處理MDCK細(xì)胞24 h。流式細(xì)胞術(shù)檢測MPTP開放情況和細(xì)胞凋亡率;熒光檢測線粒體變化和線粒體基質(zhì)腫脹;JC-1探針檢測線粒體膜電位的變化;免疫印跡法檢測Bax與Bcl-2表達(dá)量、caspase-9、caspase-3和PARP蛋白活化情況、CytC和AIF釋放。結(jié)果顯示,抑制劑CsA能夠顯著或極顯著抑制慶大霉素引起的MDCK細(xì)胞MPTP的開放、細(xì)胞凋亡率的上升、線粒體腫脹、ATP含量的減少、線粒體膜電位下降、Bcl-2/Bax比值下降、caspase-9、caspase-3和PARP蛋白的活化以及Cyt C與AIF的釋放(P0.05或P0.01)。說明MPTP正向調(diào)節(jié)慶大霉素引起的MDCK細(xì)胞線粒體凋亡。3、依達(dá)拉奉在慶大霉素誘導(dǎo)MDCK細(xì)胞凋亡中的保護(hù)作用為研究依達(dá)拉奉在慶大霉素誘導(dǎo)MDCK細(xì)胞凋亡中的保護(hù)作用,本研究用4mmol/L慶大霉素和40 μmol/L依達(dá)拉奉單獨或聯(lián)合處理MDCK細(xì)胞24 h。Annexin V-FITC/PI雙染檢測細(xì)胞凋亡率,Hochest 33258染色觀察細(xì)胞核形態(tài)的變化,比色法檢測T-SOD、GSH-Px、CAT活力和MDA含量,熒光染色檢測ROS含量,免疫印跡法檢測Bax與Bcl-2表達(dá)量、caspase-9、caspase-3和PARP蛋白活化情況以及Cyt C與AIF釋放。結(jié)果顯示,依達(dá)拉奉能夠顯著或極顯著抑制慶大霉素引起的MDCK細(xì)胞凋亡率的上升;細(xì)胞核形態(tài)的改變;ROS含量的升高;T-SOD、GSH-Px活力上升,CAT活力下降,MDA含量上升;Bcl-2/Bax比值下降、caspase-9、caspase-3和PARP蛋白的活化以及CytC與AIF的釋放(P0.05或P0.01)。說明依達(dá)拉奉能抑制慶大霉素通過線粒體凋亡通路誘導(dǎo)MDCK細(xì)胞凋亡。
【圖文】：

慶大霉素（ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ，邋ＧＭ）是一種廣泛應(yīng)用于臨床的具有較強(qiáng)抗菌活性和較廣抗逡逑菌譜的氨基糖苷類抗生素，主要由絳紅小單孢菌、棘孢小單孢菌等小單孢菌發(fā)酵產(chǎn)生。其逡逑結(jié)構(gòu)［１］如圖１所示，是由２－脫氧鏈霉胺在ＣＭ和Ｃ－６上通過糖苷鍵與加拉糖胺和絳紅糖胺逡逑連接形成。目前應(yīng)用的慶大霉素主要成分是慶大霉素Ｃ組分，包含Ｃｌ、Ｃｌａ、Ｃ２三個主逡逑要組分［２】。而３個組分的功效和毒性互不相同：Ｃ１組分療效較差，但毒性最小且不容易逡逑產(chǎn)生耐藥性；Ｃｌａ和Ｃ２兩個組分療效高，但毒性相對較大且容易產(chǎn)生耐藥性。逡逑ＯＨ逡逑ｎｈ２邐。逡逑ｈ２ｎ邋］ｈ0＾＾＼ＮＨ２逡逑ｈ２ｎ，逡逑圖１慶大霉素化學(xué)結(jié)構(gòu)式逡逑Ｆｉｇ邋１邋Ｔｈｅ邋ｃｈｅｍｉｃａｌ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ邋ｆｏｒｍｕｌａ邋ｏｆ邋ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ逡逑２慶大霉素的抗菌機(jī)制逡逑慶大霉素主要作用于細(xì)菌體內(nèi)的核糖體，可以直接與３０Ｓ亞基上的１６ＳｒＲＮＡ結(jié)合，逡逑干擾ｆｏｒｍｙｌ－ｍｅｔｈｉｏｎｙｌ－ｔＲＮＡ與３０ＳｒＲＮＡ的連接，導(dǎo)致ｍＲＮＡ發(fā)生翻譯錯誤，從而干擾逡逑細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成，，最終造成細(xì)菌死亡［３］。逡逑慶大霉素具有較強(qiáng)的殺菌作用

２．１慶大霉素對ＭＤＣＫ細(xì)胞存活率的影響逡逑不同濃度（０、２、４、８ｍｍｏｌ／Ｌ）慶大霉素處理ＭＤＣＫ細(xì)胞２４ｈ，采用ＣＣＫ－８法檢逡逑測細(xì)胞存活率。如圖２－１－１邋（Ａ）所示，隨著慶大霉素染毒濃度的增加，細(xì)胞活性隨之減逡逑少，與對照組相比，當(dāng)慶大霉素達(dá)到２ｍｍｏｌ／Ｌ、４ｍｍｏｌ／Ｌ和８ｍｍｏｌ／Ｌ時細(xì)胞存活率呈極逡逑顯著下降趨勢（Ｐ＜０．０１），且當(dāng)慶大霉素為８ｍｍｏｌ／Ｌ時，細(xì)胞活性僅為５０．１％。逡逑４ｍｍｏｌ／Ｌ慶大霉素處理ＭＤＣＫ細(xì)胞不同時間（０、６、１２、２４ｈ），采用ＣＣＩＣ－８法檢逡逑測細(xì)胞存活率。如圖２－１－１邋（Ｂ）所示，隨著染毒時間的延長，細(xì)胞存活率隨之降低，當(dāng)逡逑染毒時間到達(dá)１２邋ｈ、２４邋ｈ時，與對照組相比，細(xì)胞存活率差異極顯著（Ｐ＜０．０１）。逡逑（Ａ）邐（Ｂ）逡逑１２５－，邐１２５－逡逑ｌｉｉｉ邋ｌｌｉｉ逡逑０邐２邐４邐８邋（ｍＭ）邐０邐６邐１２邐２４邋（ｈ）逡逑圖２－Ｍ慶大霉素對ＭＤＣＫ細(xì)胞存活率的影響逡逑（Ａ）不同濃度慶大霉素處理ＭＤＣＫ細(xì)胞２４邋ｈ后對細(xì)胞存活率的影響逡逑（Ｂ）邋４邋ｍｍｏｌ／Ｌ慶大霉素處理ＭＤＣＫ細(xì)胞不同時間后對細(xì)胞存活率的影響逡逑注：與對照組相比
【學(xué)位授予單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S859.7

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