【摘要】：犬猝死癥可導(dǎo)致幼齡或青壯齡犬快速死亡,患病動物在發(fā)病后數(shù)小時內(nèi)死亡,通�？梢饸庑詨木�、腸毒血癥、出血性腸炎等病癥,發(fā)病后通常由于無法及時治療而導(dǎo)致死亡,因此,針對犬猝死癥應(yīng)以預(yù)防為主,但目前臨床上還沒有預(yù)防犬猝死癥的疫苗。引起犬猝死癥的病原主要是產(chǎn)氣莢膜梭菌和肉毒桿菌,其中產(chǎn)氣莢膜梭菌又是最主要的病原菌。產(chǎn)氣莢膜梭菌為一種廣泛分布于自然界的革蘭氏陽性菌,兼性厭氧,可形成芽孢。產(chǎn)氣莢膜梭菌根據(jù)其所產(chǎn)生的四種主要外毒素(α、β、ε、ι)的基因型不同,可分為A型、B型、C型、D型、E型,其中以A型最為常見,其主要毒力因子是α毒素。肉毒桿菌為革蘭氏陽性厭氧菌,主要毒力因子是分泌的肉毒毒素。肉毒毒素可分為A、B、C、D、E、F、G等七個型,其中引起人致病的通常為A型肉毒毒素,引起動物致病常見的為C型肉毒毒素。為了研究犬猝死癥疫苗,本研究首先分別建立了產(chǎn)氣莢膜梭菌和肉毒毒素動物感染模型(小鼠和犬);然后利用甲醛對培養(yǎng)后的菌液或毒素進行脫毒,優(yōu)化疫苗有效劑量和佐劑,利用動物模型分別評價產(chǎn)氣莢膜梭菌滅活疫苗和肉毒毒素滅活疫苗的安全性和免疫學(xué)特性;再優(yōu)化兩種疫苗的比例,制備出預(yù)防犬猝死癥的二聯(lián)滅活疫苗。一、A型產(chǎn)氣莢膜梭菌滅活疫苗的研究以不同劑量的產(chǎn)氣莢膜梭菌培養(yǎng)物分別對昆明鼠和比格犬通過腹腔注射進行攻毒,建立了產(chǎn)氣莢膜梭菌感染小鼠模型和犬模型。產(chǎn)氣莢膜梭菌對小鼠和犬的最小致死劑量(MLD)分別是200μL/只(活菌數(shù)約為6×10~7 CFU)和2,000μL/只(活菌數(shù)約為6×10~8 CFU),感染后1天內(nèi)動物全部死亡,主要臨床癥狀表現(xiàn)為動物腹部鼓脹,四肢無力,行動遲緩,肛門處有出血,組織病理切片顯示小腸出現(xiàn)大量炎性細胞浸潤,肺泡壁增厚且肺間質(zhì)有炎性細胞浸潤,肝臟中央靜脈周圍有輕微纖維化。利用甲醛對產(chǎn)氣莢膜梭菌培養(yǎng)物進行滅活,優(yōu)化了甲醛對產(chǎn)氣莢膜梭菌的滅活條件為0.5%甲醛終濃度脫毒48 h。將脫毒后的產(chǎn)氣莢膜梭菌培養(yǎng)液分別與油佐劑和鋁膠佐劑混合后,分別以腹腔注射和皮下注射的途徑免疫小鼠,用ELISA方法檢測小鼠血清抗體。結(jié)果免疫小鼠血清抗體效價最高可達10~5,皮下注射免疫小鼠的血清抗體水平明顯高于腹腔注射免疫小鼠,添加鋁佐劑的疫苗免疫產(chǎn)生的血清抗體水平略高于油佐劑疫苗免疫產(chǎn)生的抗體水平。利用小鼠評價產(chǎn)氣莢膜梭菌滅活疫苗的免疫保護作用,以200μL/只的劑量對小鼠進行注射免疫2次,免疫間隔14天。加強免疫后第14天進行攻毒,結(jié)果鋁佐劑皮下注射免疫組小鼠全部存活(10/10),其他免疫組小鼠均有不同程度的死亡,而對照組小鼠全部死亡,表明疫苗具有良好的免疫保護效果。利用小鼠開展的長期免疫水平監(jiān)測,結(jié)果表明小鼠血清抗體于免疫后第28天最高,然后緩慢下降,直到免疫后第120天,抗體水平仍處于較高水平。利用本動物犬評價產(chǎn)氣莢膜梭菌滅活疫苗的免疫保護作用,分別以0.5 mL/只、1 mL/只、2 mL/只、4 mL/只的劑量對犬進行免疫,結(jié)果采用兩次免疫方法(免疫間隔14天),2 mL/只劑量即可對犬完全保護(5/5);采用一次免疫攻毒法,4 mL/只免疫劑量才可對小鼠完全保護(5/5)。本研究還制備了α毒素滅活疫苗。將產(chǎn)氣莢膜梭菌在產(chǎn)毒培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)后,離心收集上清,加甲醛使終濃度達到0.5%脫毒48 h后,加入飽和硫酸銨至飽和度為50%,4℃過夜后離心收集沉淀,用原始體積1/10量的PBS溶解,即得到粗提α毒素,將毒素蛋白添加鋁膠佐劑后制備毒素滅活疫苗。對犬進行免疫保護性實驗,通過皮下免疫犬后在第14天腹腔注射進行攻毒,結(jié)果0.5 mL/只劑量單次免疫即可產(chǎn)生完全免疫保護效果(5/5)。二、肉毒毒素滅活疫苗的研究根據(jù)報道的C型肉毒毒素基因序列(GenBank登陸號:D90210),根據(jù)大腸桿菌的密碼子嗜性進行優(yōu)化,合成了優(yōu)化后的C型肉毒毒素基因BoNT-C,將合成的BoNT-C基因定向克隆至溫控表達性質(zhì)粒pBV220的EcoRI和BamHI位點之間,構(gòu)建出攜帶C型肉毒毒素基因的溫控表達重組質(zhì)粒pBV220-BoNT-C,將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α,構(gòu)建出可表達C型肉毒毒素的重組菌株DH5α(pBV220-BoNT-C)。以不同劑量的產(chǎn)C型肉毒毒素重組菌株DH5α(pBV220-BoNT-C)培養(yǎng)物分別對昆明鼠和比格犬進行腹腔注射,結(jié)果對小鼠和犬的最小致死劑量(MLD)分別是20μL菌液(活菌數(shù)約為1.2×10~7 CFU)和1,000μL菌液(活菌數(shù)約為6×10~8CFU),感染后1天內(nèi)動物全部死亡,主要臨床癥狀表現(xiàn)為動物呼吸急促,行動遲緩,抬頭困難等。利用甲醛對重組菌株DH5α(pBV220-BoNT-C)培養(yǎng)物進行滅活,優(yōu)化滅活條件為0.5%甲醛濃度脫毒24 h。將脫毒后的產(chǎn)肉毒毒素大腸桿菌培養(yǎng)液與鋁膠佐劑和油佐劑按比例混合后,分別以皮下注射和腹腔注射的途徑免疫小鼠。用ELISA方法檢測小鼠血清抗體,結(jié)果免疫小鼠血清抗體效價最高可達10~4,鋁佐劑組產(chǎn)生抗體水平高于油佐劑組。利用小鼠評價產(chǎn)C型肉毒毒素大腸桿菌滅活疫苗的免疫保護作用,以200μL/只的劑量對小鼠進行注射免疫2次,免疫間隔14天,加強免疫后第14天進行攻毒,結(jié)果鋁佐劑皮下注射組和鋁佐劑腹腔注射組小鼠全部存活(10/10),其他免疫組小鼠均有不同程度的死亡,而對照組小鼠全部死亡,表明滅活疫苗具有良好的免疫保護效果。利用小鼠開展的長期免疫水平監(jiān)測,結(jié)果表明小鼠血清抗體在免疫后第35天達到最高水平,而后略微下降,從第70天開始至第120天抗體水平雖略微下降但維持在較高水平。利用本動物犬評價產(chǎn)C型肉毒毒素大腸桿菌DH5α滅活疫苗的免疫保護作用,分別以0.5 mL/只、1 mL/只、2 mL/只、4 mL/只的劑量對犬進行免疫,結(jié)果采用兩次免疫方法(免疫間隔14天),2 mL/只劑量即可對犬完全保護(5/5);采用一次免疫攻毒法,4 mL/只免疫劑量可對犬完全保護(5/5)。本研究制備了肉毒毒素滅活疫苗。將產(chǎn)C型肉毒毒素大腸桿菌DH5α在LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)后,離心收集上清,加甲醛使終濃度達到0.5%脫毒24 h后,加入飽和硫酸銨至飽和度為50%,4℃過夜后離心收集沉淀,用原始體積1/10量的PBS溶解,即得到肉毒毒素,將毒素蛋白添加鋁膠佐劑后制備毒素滅活疫苗。對犬進行免疫保護性實驗,通過皮下免疫犬后在第14天腹腔注射進行攻毒,結(jié)果1 mL/只劑量單次免疫即可產(chǎn)生完全免疫保護效果(5/5)。三、犬猝死癥二聯(lián)(α毒素和肉毒毒素)滅活疫苗的研究將α毒素滅活疫苗和肉毒毒素滅活疫苗按1:1、1:2、1:4的毒素蛋白比例混合制備二聯(lián)滅活疫苗。利用小鼠和犬評價二聯(lián)滅活疫苗的免疫效果,以200μL/只劑量通過皮下注射對小鼠進行兩次免疫,免疫間隔14天,以2 mL/只劑量通過皮下注射對犬進行2次免疫,免疫間隔14天,加強免疫后第14天分別注射產(chǎn)氣莢膜梭菌培養(yǎng)物和產(chǎn)C型肉毒毒素重組大腸桿菌培養(yǎng)物進行攻毒,結(jié)果混合比例為1:2組對兩種毒素同時產(chǎn)生完全免疫保護效果,小鼠(5/5)和實驗犬(5/5)全部存活。對未免疫對照組攻毒后死亡犬采集組織進行切片鏡檢,并對免疫組攻毒后的犬和正常犬安樂死后采集組織進行切片鏡檢,結(jié)果免疫組與正常犬組織均無明顯病理變化,未免疫對照組犬經(jīng)產(chǎn)氣莢膜梭菌攻毒后小腸的病理切片出現(xiàn)大量的炎性細胞浸潤,肺泡壁明顯增厚且肺間質(zhì)出現(xiàn)大量炎性細胞浸潤,肝臟中央靜脈纖維化�？偨Y(jié)本研究的結(jié)果:(1)建立了A型產(chǎn)氣莢膜梭菌及產(chǎn)C型肉毒毒素大腸桿菌動物感染模型(小鼠、犬);(2)分別制備了犬A型產(chǎn)氣莢膜梭菌及C型肉毒毒素滅活疫苗,優(yōu)化了疫苗制備方法和免疫方式,動物實驗證實疫苗具有良好的安全性和免疫保護作用;(3)制備了犬猝死癥二聯(lián)(α毒素和肉毒毒素)滅活疫苗,優(yōu)化了疫苗組分配比,動物實驗證實該疫苗具有良好的安全性和免疫保護作用,可用于預(yù)防A型產(chǎn)氣莢膜梭菌和肉毒毒素引起的犬猝死癥。
【圖文】：

表 1.3 培養(yǎng)基的選擇攻毒劑量（50 100基 0 0 培養(yǎng)基 0 0 0 1 養(yǎng)基 0 5 每組 5 只小鼠；表中數(shù)字代表小鼠死亡數(shù)梭菌及毒力基因的鑒定了預(yù)期大小的 α 毒素基因和 16SrDNA型產(chǎn)氣莢膜梭菌。

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【學(xué)位授予單位】：軍事科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S852.4

【參考文獻】

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本文編號：2628763