【摘要】：褪黑素作為多功能生物因子,具有多樣的調(diào)節(jié)作用,包括抗氧化、抗炎以及參與免疫調(diào)節(jié)等,但是關(guān)于褪黑素是否通過(guò)影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)炎癥起作用卻未知。本試驗(yàn)通過(guò)使用衣霉素處理建立3T3-L1脂肪細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型誘導(dǎo)炎癥,再用褪黑素,分別檢測(cè)了其對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與炎癥不同方面的影響以及作用機(jī)制,共獲以下結(jié)果:1.褪黑素通過(guò)上調(diào)生物節(jié)律從而緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。使用1μmol/L褪黑素(Melatonin,MT)處理成熟的脂肪細(xì)胞24h之后,檢測(cè)發(fā)現(xiàn)生物鐘基因CLOCK和BMAL1的mRNA表達(dá)顯著增加(P0.05)、PER1、PER2、CRY1、CRY2和REV-ERB的mRNA表達(dá)顯著減少(P0.05),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和炎癥相關(guān)基因表達(dá)也發(fā)生了顯著的下降;用鈣離子探針對(duì)脂肪細(xì)胞染色后發(fā)現(xiàn),褪黑素處理顯著減少鈣離子熒光強(qiáng)度從而緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激;通過(guò)檢測(cè)PER1在MT處理前后的DNA甲基化水平顯示,褪黑素通過(guò)下調(diào)生物鐘基因PER1的DNA甲基化促進(jìn)生物節(jié)律,其中甲基化結(jié)合蛋白3(Methyl-CpG-binding domain 3,MBD3)的減少最顯著;進(jìn)一步在細(xì)胞中干擾PER1后發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激關(guān)鍵通路分子ATF6的mRNA水平顯著增加(P0.05),使用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)ATF6啟動(dòng)子區(qū)有兩個(gè)位點(diǎn)可以與PER1的E-box位點(diǎn)相結(jié)合,通過(guò)熒光素酶活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)干擾PER1基因可以顯著增加兩個(gè)E-box位點(diǎn)的相對(duì)熒光活性(P0.05),說(shuō)明PER1通過(guò)負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)控ATF6緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。2.褪黑素減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。為了檢測(cè)褪黑素對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)炎癥的現(xiàn)象作用,使用2 ug/mL的衣霉素(tunicamycin,TM)處理細(xì)胞12h構(gòu)建內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的模型,再用褪黑素處理,檢測(cè)發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志因子ATF6、PERK、IRE1、GRP78、CHOP的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著上調(diào)(P0.05),炎癥相關(guān)基因IL-6、TNF-α、NF-κB、NLRP3、IL-1β的mRNA和蛋白表達(dá)也顯著增加(P0.05),說(shuō)明了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激成功誘導(dǎo)炎癥的發(fā)生,而MT處理可以緩解這種作用;此外,使用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-苯基丁酸(4-PBA)處理,發(fā)現(xiàn)當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激被抑制時(shí),炎癥相關(guān)基因表達(dá)顯著下調(diào)。又通過(guò)活體注射20 mg/kg的褪黑素和1μg/g衣霉素,發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和炎癥相關(guān)基因在脂肪組織中的表達(dá)發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞水平一致,并且通過(guò)對(duì)脂肪組織切片進(jìn)行HE染色,發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下,炎性浸潤(rùn)現(xiàn)象明顯,且ATF6的免疫組化水平顯著增加,IL-6、TNF-α、GRP78和ATF6的免疫熒光強(qiáng)度也顯著升高,而MT可以抑制這種作用,以上說(shuō)明MT可以緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。3.褪黑素減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)M1型巨噬細(xì)胞極化介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。脂肪細(xì)胞炎癥與巨噬細(xì)胞之間的作用聯(lián)系密切,本實(shí)驗(yàn)使用脂肪細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng),分別使用脂多糖(LPS)和白介素-4(IL-4)誘導(dǎo)M1和M2型巨噬細(xì)胞的成熟,脂肪細(xì)胞中超表達(dá)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激關(guān)鍵通路因子ATF6,通過(guò)檢測(cè)M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志基因IL-6、TNF-α、IFN-γ和IL-12以及M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志基因CD163、CD206、IL-10和IL-4的mRNA及蛋白表達(dá),發(fā)現(xiàn)脂肪細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下M1型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志基因表達(dá)顯著上調(diào),M2型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志基因表達(dá)顯著下降;對(duì)IFN-γ和CD163的免疫熒光染色發(fā)現(xiàn),脂肪細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以促進(jìn)IFN-γ的熒光強(qiáng)度,減弱CD163的熒光表達(dá),而在添加了褪黑素之后,這些現(xiàn)象被逆轉(zhuǎn)。此外,發(fā)現(xiàn)超表達(dá)ATF6后,炎性小體相關(guān)基因NLRP3、Pro-caspase1、Caspase1、Pro-IL-1β和IL-1β的mRNA及蛋白水平也發(fā)生了顯著的上調(diào)(P0.05),使用MT處理之后,作用相反,說(shuō)明脂肪細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以通過(guò)激活炎性小體表達(dá)促進(jìn)炎癥,而MT可以減輕這種作用。以上結(jié)果說(shuō)明了褪黑素緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。綜上所述,本試驗(yàn)明確了褪黑素在脂肪細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和炎癥中的調(diào)控作用,即褪黑素通過(guò)增加生物鐘基因節(jié)律表達(dá)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng),并且發(fā)現(xiàn)DNA甲基化、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控及巨噬細(xì)胞極化等機(jī)制參與其中。本研究為治療脂肪細(xì)胞炎癥反應(yīng)提供了新的靶點(diǎn),為研究動(dòng)物脂肪沉積的遺傳調(diào)控提供一定的理論基礎(chǔ)。
【圖文】：

圖 1-1 生物鐘的等級(jí)組織（A.A.Kondratova.et al.2013）1 A hierarchical organization of the circadian clock（A.A.Kondratova.et因的表達(dá)在 SCN 之外的不同腦結(jié)構(gòu)中有節(jié)律地振蕩，表明研究表明，這些時(shí)鐘的同步活動(dòng)對(duì)許多心理過(guò)程至關(guān)重要，對(duì)認(rèn)知功能產(chǎn)生負(fù)面影響(Reddy et al.2010; Wulff et al.2010公認(rèn)的，最近的研究表明，時(shí)鐘也涉及情緒調(diào)節(jié)，記憶和對(duì) al.2006)。因的調(diào)節(jié)機(jī)制的機(jī)制涉及基因表達(dá)，蛋白質(zhì)修飾和分泌的晝夜節(jié)律振蕩，產(chǎn)物所控制 (Ko et al.2006)。在單個(gè)或多個(gè)時(shí)鐘基因已經(jīng)被的實(shí)驗(yàn)揭示了對(duì)運(yùn)動(dòng)，行為，生理學(xué)和基因表達(dá)中的晝夜節(jié)物鐘基因及其產(chǎn)物在轉(zhuǎn)錄-翻譯反饋環(huán)中連接起來(lái)(Sheram.2007)，在鐘基因產(chǎn)物中，存在正轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子 BMAL1、CLO節(jié)因子 CRY1、CRY2、PER1、PER2 和 Rev-Erb-α，其中，BMA可以特異性的與染色質(zhì)相互作用并對(duì)其進(jìn)行修飾，，從而上調(diào)

基本的螺旋-環(huán)-螺旋 (bHLH) 蛋白質(zhì)是轉(zhuǎn)錄因子，可以是制因子，它們具有高度堿性的區(qū)域以及螺旋-環(huán)-螺旋形態(tài)，bHLH 蛋結(jié)構(gòu)域與其他 bHLH 蛋白形成同二聚體或異二聚體，從而使得它們的識(shí)別 E-box 序列的 DNA-結(jié)合基序。它們通過(guò)結(jié)合基因啟動(dòng)子區(qū)中的從而激活 PER1、PER2 以及 CRY1 和 CRY2 基因的轉(zhuǎn)錄。PER / CRY斷 BMAL1 / CLOCK 活性來(lái)抑制其自身基因的轉(zhuǎn)錄 (X.Gu et al.2012)-BMAL1 復(fù) 合 物 介 導(dǎo) 的 晝 夜 節(jié) 律 輸 出 并 且 誘 導(dǎo) 其 他 轉(zhuǎn) 錄 因 子ffield et al.2002;K.Oishi et al.2003; A.Grechez et al.2004)。第二個(gè)反饋環(huán)體 RORa 和 REV-erba 的轉(zhuǎn)錄組成的 (P.L.Lowrey et al.2004; S.M.R，該轉(zhuǎn)錄過(guò)程在白天由 CLOCK / BMAL1 復(fù)合物激活，隨后它們通過(guò)中的 Rev-erba / RORa 應(yīng)答元件對(duì) BMAL1 基因施加正向和負(fù)向rey et al.2004; S.M.Reppert et al.2002)。晝夜節(jié)律系統(tǒng)通過(guò)時(shí)鐘控制的周期基因影響其他生理過(guò)程(X Yang et al.2010;I.Schmutz et al.201S.Gery et al.2006)。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S852.3

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