【摘要】：高致病性禽流感H5N1和低致病性禽流感H9N2在全球范圍內(nèi)的廣泛傳播,加速了新型流感的發(fā)生和流感大流行的風(fēng)險。H9N2和H5N1亞型禽流感病毒常與其他亞型發(fā)生廣泛的基因重組形成致病力較高的新型病毒,如H7N9、H10N8,并且可以跨越物種障礙直接感染人類,威脅人類健康。因此,對H9N2和H5N1禽流感的預(yù)防尤為重要。禽流感病毒主要通過呼吸道、消化道等黏膜部位感染機體。通過鼻腔免疫亞單位疫苗可以引起局部的黏膜免疫反應(yīng),從而阻斷禽流感病毒原發(fā)部位的感染。將抗原完整的跨越黏膜屏障轉(zhuǎn)運是成功誘導(dǎo)黏膜免疫的關(guān)鍵。但是由于黏膜免疫系統(tǒng)的復(fù)雜性,抗原的有效轉(zhuǎn)運受到制約。雞卵黃抗體Ig Y Fc受體(Fc Ry)是雞Ig Y的轉(zhuǎn)運受體。在本實驗室前期研究中,已經(jīng)證實了Fc Ry可以將Ig Y Fc-融合蛋白跨越黏膜屏障進行轉(zhuǎn)運。在本研究中,將禽流感病毒H9N2和H5N1的主要保護性抗原HA1與雞Ig Y Fc片段融合,在Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)中表達,并輔以佐劑Cp G-ODN2007,制備二價亞單位疫苗。通過滴鼻免疫雞,顯示融合蛋白可以借助呼吸道黏膜上皮細(xì)胞表達的Fc Ry進行轉(zhuǎn)運跨越黏膜屏障,誘導(dǎo)機體產(chǎn)生了針對H9N2、H5N1禽流感病毒HA1的有效特異性黏膜免疫和全身性免疫應(yīng)答。主要結(jié)果如下:1.H9N2禽流感病毒HA1的表達及鼠抗H9N2 HA1多克隆抗體的制備成功構(gòu)建p GEX-KG-HA19原核表達載體,并在大腸桿菌BL21中誘導(dǎo)表達GST-HA19融合蛋白,將該融合蛋白純化后輔以佐劑免疫小鼠,成功制備了鼠抗H9N2HA1的高免血清,利用間接ELISA檢測抗體效價高達1:256000,經(jīng)Western Blot鑒定該多克隆抗體具有良好的特異性。2.構(gòu)建p FastBac HTb-sHA19-HA15-Fc、p FastBac HTb-sHA19-Fc重組質(zhì)粒及融合蛋白的表達與鑒定將禽流感病毒H9N2含有信號肽的HA1(sHA1)及H5N1 HA1與雞IgY Fc片段融合,構(gòu)建p Fast Bac HTb-sHA19-HA15-Fc真核表達載體;將禽流感病毒H9N2 sHA1與雞Ig Y Fc片段融合,構(gòu)建p Fast Bac HTb-sHA19-Fc真核表達載體。然后,利用Bac-to-Bac表達系統(tǒng)分別表達sHA19-HA15-Fc和sHA19-Fc融合蛋白。經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測,其蛋白大小約為140KDa、105KDa,比預(yù)測蛋白略大。應(yīng)用Western Blot分別對該融合蛋白的HA19、HA15和Fc片段進行檢測,結(jié)果顯示各蛋白均成功表達。在非還原條件下檢測蛋白大小約為280KDa、210KDa,說明該融合蛋白以二聚體的形式存在,具有類似Ig Y的分子結(jié)構(gòu)。3.sHA19-HA15-Fc融合蛋白二價亞單位疫苗對雞的免疫效果評價將sHA19-HA15-Fc融合蛋白輔以佐劑Cp G-ODN 2007滴鼻免疫雞,可以同時誘導(dǎo)有效的局部黏膜免疫和全身性免疫應(yīng)答。(1)二免后第10d,氣管和肺臟沖洗液檢測中,sHA19-HA15-Fc滴鼻免疫組抗H9N2 HA1和抗H5N1 HA1特異性s Ig A和Ig Y抗體效價均最高,除了sHA19-Fc和sHA15-Fc滴鼻免疫組外,與其他免疫組相比差異極顯著(P0.01)。(2)二免后第10d,sHA19-HA15-Fc滴鼻免疫組血清中IFN-γ、IL-2均極顯著高于sHA19-HA15滴鼻免疫組和滅活苗組(P0.01),與sHA19-Fc或sHA15-Fc滴鼻免疫組無顯著性差異。(3)二免后第10d,sHA19-HA15-Fc滴鼻免疫組脾淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)顯著高于sHA19-HA15-Fc皮下免疫組和sHA19-HA15滴鼻免疫組。(4)二免后第14d,sHA19-HA15-Fc滴鼻免疫組血清中抗H9N2 HA1和抗H5N1HA1特異性Ig Y的ELISA抗體和HI抗體水平均為最高,與sHA19-HA15滴鼻免疫組差異極顯著(P0.01)。(5)H9N2病毒攻毒后第5天,sHA19-HA15-Fc滴鼻免疫組、sHA19-Fc滴鼻免疫組的咽拭子和泄殖腔拭子均未檢測到H9N2病毒的血凝活性,其保護率均為100%,sHA19-HA15-Fc皮下免疫組、滅活苗組攻毒保護率分別為75%、87.5%,而sHA19-HA15滴鼻免疫組保護率僅為25%。該研究結(jié)果表明,將sHA19-HA15-Fc融合蛋白輔以黏膜佐劑,滴鼻免疫雞,可以利用鼻腔黏膜上皮細(xì)胞表達的Fc Ry胞轉(zhuǎn)將雞Ig Y Fc-融合蛋白跨越黏膜屏障進入血液循環(huán),誘導(dǎo)機體產(chǎn)生抗H9N2、H5N1禽流感病毒的有效局部黏膜免疫和全身性免疫應(yīng)答,完全保護免疫雞抵抗H9N2禽流感病毒的感染。
【圖文】：

苗的研究進展來，為了控制流感，我國實施了廣泛的疫苗接種計劃 苗主要包括滅活苗、減毒活疫苗、DNA 疫苗、病毒樣中，，滅活苗和減毒活疫苗使用最為廣泛，在中國至少苗 (Sun and Liu 2015)。然而，禽流感病毒在雞群中仍的雞群中也是如此 (Zhang et al 2008)。因此，迫切需流感疫情。減毒活疫苗含有流感病毒的尿囊液通過甲醛滅活制備而成，是目用疫苗的 95.5％ (Swayne 2012)。傳統(tǒng)的滅活苗是通使機體獲得良好的免疫效力。研究表明，滅活苗主要圖 1-1 甲型流感病毒結(jié)構(gòu)的示意圖 (Zhang et al 2015)Figure.1-1 Schematic diagram of an influenza A virus virion

Fc 受體 (FcRn) 的研究進展兒 Fc 受體 (FcRn) 作為一種可以使母源 IgG 轉(zhuǎn)入動物的腸上皮細(xì)胞中被分離和鑒定 (Jones and W在其他哺乳動物，包括人類、非人靈長類、反芻類達 (Leach et al1996, Mayer et al 2004)。研究表明FcRn，其發(fā)揮的作用和轉(zhuǎn)運 IgG 的時間和途徑也不新生兒的血液中，F(xiàn)cRn 還參與 IgG 跨越胎盤的胞體內(nèi)血清 IgG 的平衡 (Leach et al 1996, Ghetie an障的雙向轉(zhuǎn)運，介導(dǎo)抗原—抗體復(fù)合物的遞呈011, Li et al 2011)。 IgG 的轉(zhuǎn)運，首先要使 FcRn 與 IgG 相結(jié)合。研究圖 1-2 雞 IgY 結(jié)構(gòu)圖 (Rahman et al 2013)Figure. 1-2 Basic structure of IgY
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S852.65

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本文編號：2627810