發(fā)布時(shí)間：2020-04-14 23:00

【摘要】：高致病性禽流感H5N1和低致病性禽流感H9N2在全球范圍內(nèi)的廣泛傳播,加速了新型流感的發(fā)生和流感大流行的風(fēng)險(xiǎn)。H9N2和H5N1亞型禽流感病毒常與其他亞型發(fā)生廣泛的基因重組形成致病力較高的新型病毒,如H7N9、H10N8,并且可以跨越物種障礙直接感染人類(lèi),威脅人類(lèi)健康。因此,對(duì)H9N2和H5N1禽流感的預(yù)防尤為重要。禽流感病毒主要通過(guò)呼吸道、消化道等黏膜部位感染機(jī)體。通過(guò)鼻腔免疫亞單位疫苗可以引起局部的黏膜免疫反應(yīng),從而阻斷禽流感病毒原發(fā)部位的感染。將抗原完整的跨越黏膜屏障轉(zhuǎn)運(yùn)是成功誘導(dǎo)黏膜免疫的關(guān)鍵。但是由于黏膜免疫系統(tǒng)的復(fù)雜性,抗原的有效轉(zhuǎn)運(yùn)受到制約。雞卵黃抗體Ig Y Fc受體(Fc Ry)是雞Ig Y的轉(zhuǎn)運(yùn)受體。在本實(shí)驗(yàn)室前期研究中,已經(jīng)證實(shí)了Fc Ry可以將Ig Y Fc-融合蛋白跨越黏膜屏障進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)。在本研究中,將禽流感病毒H9N2和H5N1的主要保護(hù)性抗原HA1與雞Ig Y Fc片段融合,在Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá),并輔以佐劑Cp G-ODN2007,制備二價(jià)亞單位疫苗。通過(guò)滴鼻免疫雞,顯示融合蛋白可以借助呼吸道黏膜上皮細(xì)胞表達(dá)的Fc Ry進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)跨越黏膜屏障,誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生了針對(duì)H9N2、H5N1禽流感病毒HA1的有效特異性黏膜免疫和全身性免疫應(yīng)答。主要結(jié)果如下:1.H9N2禽流感病毒HA1的表達(dá)及鼠抗H9N2 HA1多克隆抗體的制備成功構(gòu)建p GEX-KG-HA19原核表達(dá)載體,并在大腸桿菌BL21中誘導(dǎo)表達(dá)GST-HA19融合蛋白,將該融合蛋白純化后輔以佐劑免疫小鼠,成功制備了鼠抗H9N2HA1的高免血清,利用間接ELISA檢測(cè)抗體效價(jià)高達(dá)1:256000,經(jīng)Western Blot鑒定該多克隆抗體具有良好的特異性。2.構(gòu)建p FastBac HTb-sHA19-HA15-Fc、p FastBac HTb-sHA19-Fc重組質(zhì)粒及融合蛋白的表達(dá)與鑒定將禽流感病毒H9N2含有信號(hào)肽的HA1(sHA1)及H5N1 HA1與雞IgY Fc片段融合,構(gòu)建p Fast Bac HTb-sHA19-HA15-Fc真核表達(dá)載體;將禽流感病毒H9N2 sHA1與雞Ig Y Fc片段融合,構(gòu)建p Fast Bac HTb-sHA19-Fc真核表達(dá)載體。然后,利用Bac-to-Bac表達(dá)系統(tǒng)分別表達(dá)sHA19-HA15-Fc和sHA19-Fc融合蛋白。經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè),其蛋白大小約為140KDa、105KDa,比預(yù)測(cè)蛋白略大。應(yīng)用Western Blot分別對(duì)該融合蛋白的HA19、HA15和Fc片段進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示各蛋白均成功表達(dá)。在非還原條件下檢測(cè)蛋白大小約為280KDa、210KDa,說(shuō)明該融合蛋白以二聚體的形式存在,具有類(lèi)似Ig Y的分子結(jié)構(gòu)。3.sHA19-HA15-Fc融合蛋白二價(jià)亞單位疫苗對(duì)雞的免疫效果評(píng)價(jià)將sHA19-HA15-Fc融合蛋白輔以佐劑Cp G-ODN 2007滴鼻免疫雞,可以同時(shí)誘導(dǎo)有效的局部黏膜免疫和全身性免疫應(yīng)答。(1)二免后第10d,氣管和肺臟沖洗液檢測(cè)中,sHA19-HA15-Fc滴鼻免疫組抗H9N2 HA1和抗H5N1 HA1特異性s Ig A和Ig Y抗體效價(jià)均最高,除了sHA19-Fc和sHA15-Fc滴鼻免疫組外,與其他免疫組相比差異極顯著(P0.01)。(2)二免后第10d,sHA19-HA15-Fc滴鼻免疫組血清中IFN-γ、IL-2均極顯著高于sHA19-HA15滴鼻免疫組和滅活苗組(P0.01),與sHA19-Fc或sHA15-Fc滴鼻免疫組無(wú)顯著性差異。(3)二免后第10d,sHA19-HA15-Fc滴鼻免疫組脾淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)顯著高于sHA19-HA15-Fc皮下免疫組和sHA19-HA15滴鼻免疫組。(4)二免后第14d,sHA19-HA15-Fc滴鼻免疫組血清中抗H9N2 HA1和抗H5N1HA1特異性Ig Y的ELISA抗體和HI抗體水平均為最高,與sHA19-HA15滴鼻免疫組差異極顯著(P0.01)。(5)H9N2病毒攻毒后第5天,sHA19-HA15-Fc滴鼻免疫組、sHA19-Fc滴鼻免疫組的咽拭子和泄殖腔拭子均未檢測(cè)到H9N2病毒的血凝活性,其保護(hù)率均為100%,sHA19-HA15-Fc皮下免疫組、滅活苗組攻毒保護(hù)率分別為75%、87.5%,而sHA19-HA15滴鼻免疫組保護(hù)率僅為25%。該研究結(jié)果表明,將sHA19-HA15-Fc融合蛋白輔以黏膜佐劑,滴鼻免疫雞,可以利用鼻腔黏膜上皮細(xì)胞表達(dá)的Fc Ry胞轉(zhuǎn)將雞Ig Y Fc-融合蛋白跨越黏膜屏障進(jìn)入血液循環(huán),誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗H9N2、H5N1禽流感病毒的有效局部黏膜免疫和全身性免疫應(yīng)答,完全保護(hù)免疫雞抵抗H9N2禽流感病毒的感染。
【圖文】：

苗的研究進(jìn)展來(lái)，為了控制流感，我國(guó)實(shí)施了廣泛的疫苗接種計(jì)劃 苗主要包括滅活苗、減毒活疫苗、DNA 疫苗、病毒樣中，，滅活苗和減毒活疫苗使用最為廣泛，在中國(guó)至少苗 (Sun and Liu 2015)。然而，禽流感病毒在雞群中仍的雞群中也是如此 (Zhang et al 2008)。因此，迫切需流感疫情。減毒活疫苗含有流感病毒的尿囊液通過(guò)甲醛滅活制備而成，是目用疫苗的 95.5％ (Swayne 2012)。傳統(tǒng)的滅活苗是通使機(jī)體獲得良好的免疫效力。研究表明，滅活苗主要圖 1-1 甲型流感病毒結(jié)構(gòu)的示意圖 (Zhang et al 2015)Figure.1-1 Schematic diagram of an influenza A virus virion

Fc 受體 (FcRn) 的研究進(jìn)展兒 Fc 受體 (FcRn) 作為一種可以使母源 IgG 轉(zhuǎn)入動(dòng)物的腸上皮細(xì)胞中被分離和鑒定 (Jones and W在其他哺乳動(dòng)物，包括人類(lèi)、非人靈長(zhǎng)類(lèi)、反芻類(lèi)達(dá) (Leach et al1996, Mayer et al 2004)。研究表明FcRn，其發(fā)揮的作用和轉(zhuǎn)運(yùn) IgG 的時(shí)間和途徑也不新生兒的血液中，F(xiàn)cRn 還參與 IgG 跨越胎盤(pán)的胞體內(nèi)血清 IgG 的平衡 (Leach et al 1996, Ghetie an障的雙向轉(zhuǎn)運(yùn)，介導(dǎo)抗原—抗體復(fù)合物的遞呈011, Li et al 2011)。 IgG 的轉(zhuǎn)運(yùn)，首先要使 FcRn 與 IgG 相結(jié)合。研究圖 1-2 雞 IgY 結(jié)構(gòu)圖 (Rahman et al 2013)Figure. 1-2 Basic structure of IgY
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：S852.65

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