【摘要】：隱孢子蟲(Cryptosporidium)是一種世界性分布的人獸共患寄生性原蟲,寄生于宿主消化道上皮細胞刷狀緣納蟲空泡,它會引起人和多種動物腹瀉,尤其是它可引起免疫缺陷或免疫抑制者致死性腹瀉,對人類和牲畜健康造成嚴重威脅。造成奶牛隱孢子蟲病的主要有微小隱孢子蟲、安氏隱孢子蟲及牛隱孢子蟲。其中造成斷奶前犢牛腹瀉、消瘦、生長發(fā)育緩慢的主要是微小隱孢子蟲。本病流行較廣,可通過污水、糞便、食物相互傳播,孢子化的卵囊經(jīng)口進入消化道定殖,微創(chuàng)性損傷消化道造成病牛免疫力下降,給其他病原體入侵提供機會。根據(jù)河北省各個奶牛養(yǎng)殖場的流行病學調(diào)查,隱孢子蟲的平均感染率為5.8%,導致奶牛養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟損失慘重,目前尚無有效的治療方法。因此,研究微小隱孢子蟲的入侵及致病機制,對預防、治療微小隱孢子蟲病具有重要的意義。本試驗建立微小隱孢子蟲感染小鼠模型,取三周齡BALB/c小鼠,用醋酸地塞米松15g/ml免疫抑制1周,灌胃感染微小隱孢子蟲,接種卵囊后分別在1d、3d、7d、14d分離小鼠小腸上皮細胞,提取mRNA后反轉(zhuǎn)錄成cDNA,利用熒光定量PCR分別檢測IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6的相對表達量。結(jié)果顯示感染后的小腸IFN-γ、TNF-α在1d、3d、7d、14d表達均顯著升高(P0.05),且差異顯著。IL-2在感染后1d、3d、7d表達量相對于對照組差異不顯著(P0.05),14天表達量顯著上升(P0.01)。IL-4在感染后1d、3d和7 d呈緩慢上升趨勢,與對照組相比略有升高但差異并不明顯(P0.05),感染后14天表達量升高,是對照組的5.04倍,相對于對照組差異顯著(P0.01)。IL-6的表達在感染初期呈穩(wěn)定趨勢,在感染后1d、3d和7 d與對照組相比表達量差異顯著(P0.05),均在對照組的2~3倍之間,感染后14天表達量略有下降,相對于對照組差異不顯著(P0.05),但仍高于對照組。分析結(jié)果可知IFN-γ、TNF-α表達顯著升高說明機體通過依賴于IFN-γ、TNF-α的調(diào)節(jié)機制從而阻止和限制微小隱孢子蟲近一步的感染,同時誘導機體IL-2、IL-4、IL-6水平的升高,在感染的后期發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。IFN-γ、TNF-α、IL-2是Th1型免疫應答主要的細胞因子,提示Th1型免疫應答與宿主抵抗微小隱孢子蟲感染的免疫防御有關,以IL-4為代表的Th2型細胞免疫在抵抗及清除微小隱孢子蟲感染中發(fā)揮作用。取感染微小隱孢子蟲卵囊一周的小鼠,用Trizol(Invitrogen,USA)試劑盒提取其小腸組織總RNA,采用甲醛變性瓊脂糖凝膠以及Bioanalyzer 2100對RNA進行質(zhì)量檢測,樣品檢測合格后,使用Small RNA Sample Pre Kit構(gòu)建文庫,文庫構(gòu)建完成后,先使用Qubit2.0進行初步定量,保證文庫質(zhì)量。將上述生成的文庫送至北京諾禾致源科技有限公司進行HiSeq測序,對原始數(shù)據(jù)進行以下方面處理,即去除接頭、污染序列及低質(zhì)量reads,分別對試驗組和對照組的microRNA表達量進行生物信息學分析;對差異表達的microRNA靶基因進行Geneontology(GO)富集分析和KEGG Pathways富集分析;通過實時定量PCR驗證對差異表達microRNA進行驗證。結(jié)果表明差異表達的microRNA共204個,其中表達量上調(diào)的有126個,下調(diào)的有78個;這些microRNA參與Ras信號通路,微生物感染、癌癥途徑、受體相互作用途徑,以及趨化因子和細胞因子受體的相互作用等;實時定量PCR驗證了部分差異表達microRNA(mmu-miR-10、mmu-miR-196、mmu-miR-27、mmu-miR-146、mmu-miR-145、mmu-miR-21、mmu-miR-1981、let-7i和mmu-miR-101),與高通量測序結(jié)果一致。通過雙熒光素酶報告試驗對篩選出的差異表達microRNA miR-196對靶基因TLR-11的作用進行驗證,把TLR-11基因的部分3’UTR區(qū)連接到pmir-GLO載體上,將mmu-miR-196模擬物及載體一同轉(zhuǎn)染進293T細胞中培養(yǎng)48小時。按照雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)試劑盒說明書利用多功能酶標儀檢測出發(fā)光值。結(jié)果,相對于對照組,試驗組的螢火蟲熒光發(fā)光值相對于海腎熒光發(fā)光值的差異相對顯著(P0.05)。證明miR-196能與TLR-11基因的3’UTR區(qū)特異性結(jié)合,從而判斷TLR-11是miR-196的靶基因。
【圖文】：

-UTR 堿基正常鏈（176bp）AGAGCTGGACAAGAAAGAGATTAAGGACTGCAGGAATGCTGTTGTGCCAGCAGCAGAGGGAATGTGCTCTCATCACTAAAGCATGGGCTCACCAAATATATTAAATTCCACTGGGAGAGAAGTCTTTTAAAACACTGAAACTC’-UTR 堿基突變鏈（176bp）AGAGCTGGACAAGAAAGAGATTAAGGACTGCAGGAATGCTGTTGTGCGTCGTCGTGAGGGAATGTGCTCTCATCACTAAAGCATGGGCTCACCAATATATTAAATTCCACTGGGAGAGAAGTCTTTTAAAACACTGAAACTCG1 mRNA基因 3’-UTR 的第 2932-2954 堿基位置可能存在與miR-196不完全圖 1 所示。

圖 4 反轉(zhuǎn)錄-實時熒光定量 PCR 引物驗證結(jié)果esult of testing primers of reverse transcription quantitative reaM：DL-1000Marker1:IL-2 2:IL-4 3:IL-6 4:TNF-α 5:GAPDH 6:IFN-γ測定 1×105-1×101梯度倍比稀釋 5 個濃度，分別擴增 。反應結(jié)束后系統(tǒng)根據(jù)羅氏實時熒光定量 PCR 熒光量變化的擴增曲線。并用 LightCycler96 SW 1F-α、GAPDH、IL-2、IL-4、IL-6 擴增曲線如圖 5 高，內(nèi)參基因和目標基因擴增效率分別為 1.16、1.因擴增效率基本一致，說明引物擴增效率高，，具有
【學位授予單位】：河北農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S852.723

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本文編號：2626176