【摘要】：隱孢子蟲(chóng)(Cryptosporidium)是一種世界性分布的人獸共患寄生性原蟲(chóng),寄生于宿主消化道上皮細(xì)胞刷狀緣納蟲(chóng)空泡,它會(huì)引起人和多種動(dòng)物腹瀉,尤其是它可引起免疫缺陷或免疫抑制者致死性腹瀉,對(duì)人類(lèi)和牲畜健康造成嚴(yán)重威脅。造成奶牛隱孢子蟲(chóng)病的主要有微小隱孢子蟲(chóng)、安氏隱孢子蟲(chóng)及牛隱孢子蟲(chóng)。其中造成斷奶前犢牛腹瀉、消瘦、生長(zhǎng)發(fā)育緩慢的主要是微小隱孢子蟲(chóng)。本病流行較廣,可通過(guò)污水、糞便、食物相互傳播,孢子化的卵囊經(jīng)口進(jìn)入消化道定殖,微創(chuàng)性損傷消化道造成病牛免疫力下降,給其他病原體入侵提供機(jī)會(huì)。根據(jù)河北省各個(gè)奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)的流行病學(xué)調(diào)查,隱孢子蟲(chóng)的平均感染率為5.8%,導(dǎo)致奶牛養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟(jì)損失慘重,目前尚無(wú)有效的治療方法。因此,研究微小隱孢子蟲(chóng)的入侵及致病機(jī)制,對(duì)預(yù)防、治療微小隱孢子蟲(chóng)病具有重要的意義。本試驗(yàn)建立微小隱孢子蟲(chóng)感染小鼠模型,取三周齡BALB/c小鼠,用醋酸地塞米松15g/ml免疫抑制1周,灌胃感染微小隱孢子蟲(chóng),接種卵囊后分別在1d、3d、7d、14d分離小鼠小腸上皮細(xì)胞,提取mRNA后反轉(zhuǎn)錄成cDNA,利用熒光定量PCR分別檢測(cè)IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示感染后的小腸IFN-γ、TNF-α在1d、3d、7d、14d表達(dá)均顯著升高(P0.05),且差異顯著。IL-2在感染后1d、3d、7d表達(dá)量相對(duì)于對(duì)照組差異不顯著(P0.05),14天表達(dá)量顯著上升(P0.01)。IL-4在感染后1d、3d和7 d呈緩慢上升趨勢(shì),與對(duì)照組相比略有升高但差異并不明顯(P0.05),感染后14天表達(dá)量升高,是對(duì)照組的5.04倍,相對(duì)于對(duì)照組差異顯著(P0.01)。IL-6的表達(dá)在感染初期呈穩(wěn)定趨勢(shì),在感染后1d、3d和7 d與對(duì)照組相比表達(dá)量差異顯著(P0.05),均在對(duì)照組的2~3倍之間,感染后14天表達(dá)量略有下降,相對(duì)于對(duì)照組差異不顯著(P0.05),但仍高于對(duì)照組。分析結(jié)果可知IFN-γ、TNF-α表達(dá)顯著升高說(shuō)明機(jī)體通過(guò)依賴(lài)于IFN-γ、TNF-α的調(diào)節(jié)機(jī)制從而阻止和限制微小隱孢子蟲(chóng)近一步的感染,同時(shí)誘導(dǎo)機(jī)體IL-2、IL-4、IL-6水平的升高,在感染的后期發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。IFN-γ、TNF-α、IL-2是Th1型免疫應(yīng)答主要的細(xì)胞因子,提示Th1型免疫應(yīng)答與宿主抵抗微小隱孢子蟲(chóng)感染的免疫防御有關(guān),以IL-4為代表的Th2型細(xì)胞免疫在抵抗及清除微小隱孢子蟲(chóng)感染中發(fā)揮作用。取感染微小隱孢子蟲(chóng)卵囊一周的小鼠,用Trizol(Invitrogen,USA)試劑盒提取其小腸組織總RNA,采用甲醛變性瓊脂糖凝膠以及Bioanalyzer 2100對(duì)RNA進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè),樣品檢測(cè)合格后,使用Small RNA Sample Pre Kit構(gòu)建文庫(kù),文庫(kù)構(gòu)建完成后,先使用Qubit2.0進(jìn)行初步定量,保證文庫(kù)質(zhì)量。將上述生成的文庫(kù)送至北京諾禾致源科技有限公司進(jìn)行HiSeq測(cè)序,對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行以下方面處理,即去除接頭、污染序列及低質(zhì)量reads,分別對(duì)試驗(yàn)組和對(duì)照組的microRNA表達(dá)量進(jìn)行生物信息學(xué)分析;對(duì)差異表達(dá)的microRNA靶基因進(jìn)行Geneontology(GO)富集分析和KEGG Pathways富集分析;通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證對(duì)差異表達(dá)microRNA進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明差異表達(dá)的microRNA共204個(gè),其中表達(dá)量上調(diào)的有126個(gè),下調(diào)的有78個(gè);這些microRNA參與Ras信號(hào)通路,微生物感染、癌癥途徑、受體相互作用途徑,以及趨化因子和細(xì)胞因子受體的相互作用等;實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證了部分差異表達(dá)microRNA(mmu-miR-10、mmu-miR-196、mmu-miR-27、mmu-miR-146、mmu-miR-145、mmu-miR-21、mmu-miR-1981、let-7i和mmu-miR-101),與高通量測(cè)序結(jié)果一致。通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)對(duì)篩選出的差異表達(dá)microRNA miR-196對(duì)靶基因TLR-11的作用進(jìn)行驗(yàn)證,把TLR-11基因的部分3’UTR區(qū)連接到pmir-GLO載體上,將mmu-miR-196模擬物及載體一同轉(zhuǎn)染進(jìn)293T細(xì)胞中培養(yǎng)48小時(shí)。按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)試劑盒說(shuō)明書(shū)利用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)出發(fā)光值。結(jié)果,相對(duì)于對(duì)照組,試驗(yàn)組的螢火蟲(chóng)熒光發(fā)光值相對(duì)于海腎熒光發(fā)光值的差異相對(duì)顯著(P0.05)。證明miR-196能與TLR-11基因的3’UTR區(qū)特異性結(jié)合,從而判斷TLR-11是miR-196的靶基因。
【圖文】：

-UTR 堿基正常鏈（176bp）AGAGCTGGACAAGAAAGAGATTAAGGACTGCAGGAATGCTGTTGTGCCAGCAGCAGAGGGAATGTGCTCTCATCACTAAAGCATGGGCTCACCAAATATATTAAATTCCACTGGGAGAGAAGTCTTTTAAAACACTGAAACTC’-UTR 堿基突變鏈（176bp）AGAGCTGGACAAGAAAGAGATTAAGGACTGCAGGAATGCTGTTGTGCGTCGTCGTGAGGGAATGTGCTCTCATCACTAAAGCATGGGCTCACCAATATATTAAATTCCACTGGGAGAGAAGTCTTTTAAAACACTGAAACTCG1 mRNA基因 3’-UTR 的第 2932-2954 堿基位置可能存在與miR-196不完全圖 1 所示。

圖 4 反轉(zhuǎn)錄-實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 引物驗(yàn)證結(jié)果esult of testing primers of reverse transcription quantitative reaM：DL-1000Marker1:IL-2 2:IL-4 3:IL-6 4:TNF-α 5:GAPDH 6:IFN-γ測(cè)定 1×105-1×101梯度倍比稀釋 5 個(gè)濃度，分別擴(kuò)增 。反應(yīng)結(jié)束后系統(tǒng)根據(jù)羅氏實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 熒光量變化的擴(kuò)增曲線。并用 LightCycler96 SW 1F-α、GAPDH、IL-2、IL-4、IL-6 擴(kuò)增曲線如圖 5 高，內(nèi)參基因和目標(biāo)基因擴(kuò)增效率分別為 1.16、1.因擴(kuò)增效率基本一致，說(shuō)明引物擴(kuò)增效率高，，具有
【學(xué)位授予單位】：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：S852.723

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本文編號(hào)：2626176