【摘要】：肝缺血再灌注損傷(Ischemia-reperfusion injury IRI)是臨床上亟待解決的問(wèn)題。近年研究表明,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(Endoplasmic reticulum stress ERS)在肝缺血再灌注中有著重要作用。對(duì)ERS反應(yīng)途徑的干預(yù)可能為肝臟IRI提供新的保護(hù)手段。富氫生理鹽水(Hydrogen-rich saline HRS)具有抗氧化,抗炎,抗凋亡的作用,對(duì)各種器官IRI具有廣泛的保護(hù)作用。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn),HRS能夠通過(guò)抑制ERS,減輕肝IRI,然而其機(jī)制尚不明確,而HRS對(duì)于腹腔鏡技術(shù)建立的小型豬肝臟缺血再灌注合并肝部分切除模型中ERS影響的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用腹腔鏡手術(shù)建立小型豬肝臟缺血再灌注合并肝部分切除模型,并應(yīng)用HRS干預(yù),通過(guò)跟蹤檢測(cè)干預(yù)后肝臟組織學(xué)和ERS相關(guān)指標(biāo)的變化,深入探討了HRS對(duì)肝臟缺血再灌注合并肝部分切除術(shù)后ERS的影響。本實(shí)驗(yàn)選取18頭健康小型豬,隨機(jī)分為三組,分別為假手術(shù)組(Sham組)、模型組(IRI組)和HRS干預(yù)組(HRS組)(n=6)。Sham組僅進(jìn)行翻動(dòng)肝葉,維持氣腹三小時(shí),IRI組用腹腔鏡手術(shù)建立右半肝缺血60 min合并左半肝切除模型,HRS組建立手術(shù)模型并門靜脈置管,于再灌注前10 min、再灌注6 h、術(shù)后1 d、2 d、3 d經(jīng)門靜脈注射HRS(10 mL/kg)。各組分別于術(shù)前,再灌注即刻,術(shù)后即刻,術(shù)后1 d,術(shù)后3 d經(jīng)腹腔鏡手術(shù)采取肝臟組織,進(jìn)行HE染色和電鏡檢測(cè),并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、免疫組化、Western blot等方法檢測(cè)肝中ERS參數(shù)變化情況,具體檢查指標(biāo)包括:內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白核心蛋白(GRP78),未折疊蛋白反應(yīng)(Unfolded protein reaction UPR)信號(hào)分子(PERK、IRE1、ATF6、XBP1s、p-eIF2α),ERS凋亡相關(guān)蛋白(ATF4、CHOP、p-JNK)。為研究HRS對(duì)肝損傷的保護(hù)作用,我們對(duì)肝組織病理?yè)p傷變化進(jìn)行了檢測(cè):HE染色顯示,與Sham組相比IRI組各時(shí)間點(diǎn)觀察到不同程度肝組織損傷:肝細(xì)胞索狀排列被破壞,細(xì)胞腫脹,空泡變性,并存在有壞死性病變和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。與IRI組比較,HRS組各時(shí)間點(diǎn)的肝細(xì)胞基本呈索狀排列,且HRS組中肝細(xì)胞壞死和炎癥浸潤(rùn)顯著減少;術(shù)后1 d電鏡結(jié)果顯示Sham組肝細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)正常;IRI組肝細(xì)胞線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹,結(jié)構(gòu)被破壞,糖原減少;HRS組肝細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)基本正常,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕微腫脹。GRP78是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)核心蛋白,為研究HRS對(duì)ERS的影響,我們檢測(cè)了肝組織內(nèi)GRP78表達(dá)水平變化:IRI組GRP78 mRNA表達(dá)水平分別于再灌注即刻、術(shù)后即刻、術(shù)后1 d、術(shù)后3 d顯著高于Sham組(P0.01),于再灌注即刻、術(shù)后即刻、術(shù)后1 d、術(shù)后3 d顯著高于HRS組(P0.01)。IRI組除術(shù)前外各時(shí)間點(diǎn)GRP78蛋白表達(dá)水平均顯著高于Sham組(P0.01);HRS組GRP78蛋白表達(dá)水平分別于再灌注即刻、術(shù)后1 d、術(shù)后3 d顯著低于IRI組(P0.01)。為進(jìn)一步探究HRS對(duì)ERS影響的機(jī)制,我們對(duì)UPR信號(hào)分子mRNA和蛋白表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè):IRI組PERK、IRE1、ATF6 mRNA表達(dá)水平分別于再灌注即刻、術(shù)后即刻、術(shù)后1 d顯著高于Sham組以及HRS組(P0.05或P0.01);IRI組PERK、IRE1、ATF6蛋白表達(dá)水平于再灌注即刻、術(shù)后即刻、術(shù)后1 d顯著高于Sham組,于術(shù)后1 d顯著高于HRS組(P0.05或P0.01)。ERS最終結(jié)果將導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡的產(chǎn)生,為此我們對(duì)ERS凋亡相關(guān)蛋白進(jìn)行了檢測(cè):IRI組ATF4,CHOP,p-JNK蛋白表達(dá)水平于術(shù)后即刻、術(shù)后1 d、術(shù)后3 d均顯著高于Sham組,于術(shù)后即刻、術(shù)后1 d均顯著高于HRS組(P0.05或P0.01)。綜上所述:(1)HRS顯著改善肝缺血再灌注合并肝部分切除后的肝臟病理組織損傷,改善肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。表明了HRS對(duì)肝損傷具有保護(hù)作用。(2)HRS能夠抑制肝損傷導(dǎo)致的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)核心蛋白的上調(diào),抑制UPR三條信號(hào)通路,進(jìn)而抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡蛋白的表達(dá)。表明RHS能夠抑制肝損傷中的ERS。
【圖文】：

圖 2-1 腹腔鏡手術(shù)通路Figure 2-1 Operation pathway肝周圍韌帶，使肝葉充分游離。用左彎分離鉗將膽帶從膽囊管底部穿過(guò)，然后再?gòu)挠覂?nèi)葉基部穿過(guò)；過(guò)；同時(shí)收緊兩止血帶，用雙孔卡扣固定，將右半至圖 2-5。

圖 2-1 腹腔鏡手術(shù)通路Figure 2-1 Operation pathway2.2.4.3 右半肝缺血使用電凝裝置離斷肝周圍韌帶，使肝葉充分游離。用左彎分離鉗將膽囊管與肝實(shí)質(zhì)分離，然后將一根自制的止血帶從膽囊管底部穿過(guò)，然后再?gòu)挠覂?nèi)葉基部穿過(guò)；然后將另一根帶針止血帶從右外葉基部穿過(guò)；同時(shí)收緊兩止血帶，用雙孔卡扣固定，將右半肝入肝血流阻斷。缺血 60 min。如圖 2-2 至圖 2-5。
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S857.146

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2626006