【摘要】：化膿隱秘桿菌(Trueperella pyogenes,T.pyogenes)是一種常見(jiàn)于動(dòng)物呼吸道、消化道黏膜和乳房的共生性細(xì)菌。同時(shí),T.pyogenes也是一種條件性致病菌。當(dāng)動(dòng)物處于應(yīng)激性狀態(tài)下時(shí),T.pyogenes能引起動(dòng)物發(fā)生多種炎癥疾病�；撾[秘桿菌溶血素(Pyolysin,PLO)是T.pyogenes分泌的唯一一種溶血素,是一種膽固醇依賴性溶細(xì)胞素(Cholesterol-dependent cytolysin,CDCs),也是一種成孔毒素(Pore-forming toxin,PFT)。已有研究表明,PLO接種小鼠可以引發(fā)炎癥。但是,PLO導(dǎo)致炎癥的機(jī)制仍不明確,而闡明其引發(fā)炎癥的機(jī)制對(duì)于全面揭示T.pyogenes的致病機(jī)制有一定的積極意義。本研究表達(dá)純化了重組PLO(Recombinant PLO,rPLO)、突變體蛋白rPLO W497F和rPLO D238R,以及截短蛋白rPLO D123、rPLO D4和rPLO D4 W497F,并對(duì)它們的溶血活性進(jìn)行分析。結(jié)果表明rPLO的溶血活性最強(qiáng),其次為rPLO D238R,rPLO W497F及截短蛋白rPLO D123、rPLO D4和rPLO D4 W497F幾乎沒(méi)有溶血活性。用不同濃度的重組蛋白處理J774A.1細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞毒性結(jié)果表明,rPLO蛋白在30-60 ng/mL濃度范圍內(nèi)細(xì)胞毒性較低,而隨著濃度的增加細(xì)胞毒性逐漸增強(qiáng);突變體蛋白rPLO W497F及rPLO D238R幾乎不表現(xiàn)細(xì)胞毒性。重組蛋白處理與鈣離子(Calcium,Ca~(2+))熒光探針?lè)跤腏774A.1細(xì)胞,結(jié)果表明亞裂解劑量rPLO處理的細(xì)胞內(nèi)Ca~(2+)濃度下降,rPLO D238R和rPLO W497F處理的細(xì)胞中Ca~(2+)濃度顯著高于rPLO處理的細(xì)胞。用含有不同濃度Ca~(2+)的細(xì)胞外液與rPLO共處理細(xì)胞,結(jié)果表明當(dāng)細(xì)胞外液中含有1 mmol/L Ca~(2+)時(shí),rPLO處理可以導(dǎo)致細(xì)胞中的Ca~(2+)濃度下降;當(dāng)細(xì)胞外液中Ca~(2+)濃度低于正常濃度時(shí),rPLO作用可以導(dǎo)致細(xì)胞中的Ca~(2+)濃度上調(diào)。用不同濃度的rPLO處理J774A.1細(xì)胞0.5 h,檢測(cè)表明30-60 ng/mL的rPLO對(duì)細(xì)胞鈣蛋白酶(Calpain,CAPN)的活性沒(méi)有明顯的影響,當(dāng)時(shí)間延長(zhǎng)至2 h時(shí),細(xì)胞內(nèi)CAPN活性被顯著地抑制。用亞裂解劑量的rPLO處理J774A.1細(xì)胞,western-blot檢測(cè)表明rPLO可以顯著抑制NF-κB p65的磷酸化及NFATc1的表達(dá),并且處理細(xì)胞0.5 h就能表現(xiàn)顯著的抑制效果;rPLO D238R和rPLO W497F處理組的細(xì)胞中NF-κB p65的磷酸化水平及NFATc1的表達(dá)有所上調(diào)。用亞裂解劑量的rPLO與不同濃度Ca~(2+)外液共同處理J774A.1細(xì)胞,結(jié)果表明在含有1 mmol/L CaCl_2的RPMI1640培養(yǎng)基中,由rPLO導(dǎo)致的細(xì)胞中NF-κB p65磷酸化水平降低的現(xiàn)象有所緩解,NFATc1的表達(dá)水平上調(diào)。用亞裂解劑量的rPLO處理J774A.1細(xì)胞,檢測(cè)細(xì)胞中非經(jīng)典NF-κB信號(hào)通路中幾個(gè)關(guān)鍵性蛋白,結(jié)果表明在0.5 h時(shí)NIK及p52的含量增加,p100與IKKα/β的磷酸化水平提高。用不同重組蛋白處理小鼠骨髓源性巨噬細(xì)胞(Bone marrow derived macrophages,BMDMs),檢測(cè)細(xì)胞中鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(Calcineurin,CN)的活性,結(jié)果表明所有重組蛋白均不會(huì)顯著影響細(xì)胞中CN活性。用不同蛋白處理BMDMs,結(jié)果表明rPLO可以刺激細(xì)胞產(chǎn)生大量的IL-1β;rPLO W497F及rPLO D123可以刺激細(xì)胞產(chǎn)生大量的IL-10。然后用重組蛋白刺激tlr4基因缺失的BMDMs(BMDMs~(tlr4-)),結(jié)果表明rPLO仍可刺激細(xì)胞產(chǎn)生大量的IL-1β;而rPLO W497F和rPLO D123對(duì)IL-10誘導(dǎo)能力由于tlr4基因的缺失受到完全抑制。用PLO蛋白D123結(jié)構(gòu)域的截短多肽處理BMDMs,結(jié)果表明rPLO 95-156可以上調(diào)BMDMs中IL-10的大量表達(dá)。綜上所述,本實(shí)驗(yàn)證明了PLO作用巨噬細(xì)胞(Macrophages,Mφ)可以通過(guò)兩種方式影響NF-κB信號(hào)通路。當(dāng)PLO維持完整的結(jié)構(gòu)和功能時(shí),可以通過(guò)“成孔活性”激活非經(jīng)典NF-κB信號(hào)通路;而在細(xì)胞膜結(jié)合功能受損的情況下,PLO表現(xiàn)“PAMPs樣活性”通過(guò)刺激MφTLR4活化經(jīng)典NF-κB信號(hào)通路,介導(dǎo)細(xì)胞因子的表達(dá)。本研究為全面理解T.pyogenes導(dǎo)致感染性炎癥的機(jī)制提供部分理論依據(jù)。
【圖文】：

免疫細(xì)胞例如中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞也有溶解作用[13]。有研究證實(shí)接種 PLO 可以造成實(shí)驗(yàn)動(dòng)物皮膚潰爛和死亡，并且證實(shí)了無(wú)論通過(guò)何驗(yàn)動(dòng)物的血漿中均能檢測(cè)到抗溶血素的抗體，因此可以證明 PLO 可以膽固醇依賴性溶細(xì)胞素（Cholesterol-Dependent Cytolysins, CDCs）家還包括單核增生李斯特氏菌溶血素（Listeriolysin, LLO）、肺炎鏈sin, PLY）、中間鏈球菌溶血素（Intermedilysin, ILY）、豬鏈球菌溶血?dú)馇v膜梭菌溶素 O（Perfringolysin O, PFO）等。氨基酸序列分析結(jié)s 家族的成員，但在許多方面都是獨(dú)一無(wú)二的。它的氨基酸序列與序列同源性只有 31%-41%[15]；它的十一肽基序與其 CDCs 家族成員DCs 不同的是 PLO 的溶血活性對(duì)還原劑或硫醇阻斷劑都不敏感。有相當(dāng)保守的三維結(jié)構(gòu)，由四個(gè)富含β折疊的結(jié)構(gòu)域組成，分別命名構(gòu)域，其中 D4 結(jié)構(gòu)域位于蛋白的羧基端，含有特殊的十一肽基序，，并與細(xì)胞膜上膽固醇豐富的區(qū)域相互作用，使 PLO 單體錨定在細(xì)胞D3 結(jié)構(gòu)域構(gòu)象發(fā)生變化，使蛋白單體發(fā)生寡聚化插入到細(xì)胞膜中[17]50 nm 的穿膜孔道，使細(xì)胞內(nèi)外滲透壓失衡導(dǎo)致細(xì)胞溶解死亡，由此成孔毒素（Pore-forming toxins, PFTs）[18]。

東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)碩士學(xué)位論文 MD-2 與 CD14 的介導(dǎo)下可以通過(guò) TLR4，介導(dǎo)下游信號(hào)tiation factor 88, MyD88）及腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子NFR6）的激活，使 NF-κB 活化介導(dǎo)促炎性細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄[24]。研究發(fā)現(xiàn)，在多種急慢性炎癥發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中，度的激活[25-28]。NF-κB 家族是介導(dǎo)許多促炎性細(xì)胞因錄的關(guān)鍵性蛋白質(zhì)。NF-κB 家族共有五個(gè)成員，包括：N）、RelA（p65）、RelB 以及 c-Rel。其中 RelB 以及 c- Rel 結(jié)構(gòu)域（Rel homology domain, RHD），RHD 的功與 DNA 特異序列的結(jié)合，具有核定位的作用[29]，p65激活結(jié)構(gòu)域（Transcription activation domain, TAD），可活的關(guān)鍵分子不同 NF-κB 信號(hào)通路分為兩種，一為經(jīng)κB pathway），二為非經(jīng)典的 NF-κB 信號(hào)通路（Non-canon
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S852.61

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本文編號(hào)：2622595