【摘要】：糞類圓線蟲病是流行于亞熱帶的寄生蟲病之一,危害嚴(yán)重。糞類圓線蟲有著較復(fù)雜的生活史,包括體外自由生活階段和體內(nèi)寄生階段。其中感染性三期幼蟲(iL3)是糞類圓線蟲自由生活階段唯一具有入侵宿主能力的幼蟲,iL3發(fā)育為寄生性雌蟲(pF)的過程不僅僅是一個簡單的發(fā)育過程,更是糞類圓線蟲從自由生活階段進入寄生階段一個非常重要的轉(zhuǎn)變過程。研究這兩個時期之間的發(fā)育調(diào)控機制以及iL3的入侵機制對尋找糞類圓線蟲藥物靶標(biāo)和疫苗候選分子具有非常重要的作用。近年來長非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)由于在轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面發(fā)揮重要作用而備受研究者們的關(guān)注。已有的研究證實,lncRNA參與寄生蟲感染和入侵宿主過程中毒力因子的表達,對寄生蟲成功寄生發(fā)揮了重要的作用。并且很多研究表明寄生蟲通過分泌細胞外囊泡與宿主進行信息交流,調(diào)控宿主免疫。因此本研究從lncRNA和細胞外囊泡兩方面研究iL3和pF之間的發(fā)育調(diào)控機制以及iL3入侵宿主的感染機制,為研究糞類圓線蟲藥物標(biāo)靶和疾病的控制提供新的視角。對糞類圓線蟲lncRNA和細胞外囊泡研究結(jié)果如下:1.糞類圓線蟲轉(zhuǎn)錄組測序質(zhì)量將2個不同發(fā)育階段的糞類圓線蟲RNA樣品進行檢測,RNA樣品檢測合格后,通過去除樣品rRNA、反轉(zhuǎn)錄,第一鏈合成、第二鏈合成、末端修復(fù),3’加A、連接接頭,片段選擇、含U鏈降解等步驟構(gòu)建文庫。文庫質(zhì)控合格后,利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)在糞類圓線蟲中獲得了89%以上的高質(zhì)量測序片段,感染性三期90%、寄生性雌蟲83%以上的測序片段能夠比對到參考基因組上,測序質(zhì)量較高,能夠反映糞類圓線蟲轉(zhuǎn)錄組情況。2.LncRNA的篩選LncRNA為一類長度200 bp的長鏈非編碼RNA,根據(jù)lncRNA的特點進行一系列篩選。首先保留x、j、o、u、i以及長度大于等于200 bp的轉(zhuǎn)錄本,篩選得到7126個轉(zhuǎn)錄本。其次,篩選表達量FPKM1、readscount10以及編碼能力預(yù)測CPC(score0)和CNCI(score0)都注釋為非編碼的轉(zhuǎn)錄本,最后取其交集獲得可信較高的lncRNA 1206條。3.LncRNA特征分析對篩選出來的lncRNA進行分類,并對其長度分布和外顯子個數(shù)等基本特征進行分析。根據(jù)其在基因組上的位置,糞類圓線蟲lncRNA可分為4類,其中497個基因間長鏈非編碼RNA,17個內(nèi)含子lncRNA,586個反義lncRNA和106個正義lncRNA。大多數(shù)(41%)lncRNA為基因間lncRNA,這與大多數(shù)報道的研究結(jié)果一致�；蚪Y(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)大多數(shù)lncRNA(79%)含有兩個外顯子,只有約1%的lncRNA外顯子數(shù)目大于6個。相比于mRNA,lncRNA含有較少的外顯子。lncRNA長度分布范圍200 nt至3000 nt以上,其中61%lncRNA長度在1500 nt以下,表明大部分的lncRNA的序列長度小于蛋白編碼基因的長度。4.LncRNA功能分析通過cis和trans方式對lncRNA的功能進行分析,KEGG數(shù)據(jù)庫功能注釋發(fā)現(xiàn)糞類圓線蟲lncRNA的靶基因可能參與了信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)運和代謝等多個生物學(xué)過程。5.差異表達lncRNA qRT-PCR驗證分析發(fā)現(xiàn)兩個不同發(fā)育階段共有635個差異lncRNA,其中309個lncRNA是在感染性三期中下調(diào)表達,326個lncRNA在寄生性雌蟲中上調(diào)表達。根據(jù)lncRNA差異分析結(jié)果,從中挑選出8個在兩個時期具有差異表達的lncRNA基因進行熒光定量PCR實驗,分析不同發(fā)育時期lncRNA的表達差異。結(jié)果顯示8個lncRNA的表達趨勢和利用RNA-seq及生物信息學(xué)方法計算出來的表達量一致,證明本次數(shù)據(jù)分析的準(zhǔn)確性。這些工作為今后研究糞類圓線蟲lncRNA分子功能奠定了基礎(chǔ)。6.糞類圓線蟲感染性三期細胞外囊泡的研究本研究從糞類圓線蟲感染性三期幼蟲(iL3)體外培養(yǎng)上清中分離細胞外囊泡并進行鑒定。首先,確立收集、純化糞類圓線蟲iL3的方法,建立在體外培養(yǎng)條件,之后收集糞類圓線蟲體外培養(yǎng)20-24 h的上清液,用超速離心法分離出細胞外囊泡。通過透射電鏡(Transmission Electron Microscopy,TEM)觀察磷鎢酸負(fù)染的細胞外囊泡,可見直徑約為100-200 nm的典型杯托狀囊泡結(jié)構(gòu),對糞類圓線蟲細胞外囊泡總蛋白進行質(zhì)譜鑒定,比對Uniprot蛋白數(shù)據(jù)庫,共有17種蛋白被鑒定,其中包括細胞外囊泡標(biāo)志性蛋白延伸因子。綜上所述,通過對糞類圓線蟲lncRNA和細胞外囊泡的研究,不僅對糞類圓線蟲lncRNA和細胞外囊泡的研究提供全新的認(rèn)識,并可為將來篩選糞類圓線蟲病的分子標(biāo)記奠定理論基礎(chǔ)。
【圖文】：

華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2019 屆碩士研究生畢業(yè)論文（autoinfectivelarve,L3a） (圖 1-1)�；颊呙庖吡^強時，體內(nèi)維持一個非常低的自感染長期隱形感染。當(dāng)宿主免疫力降低或患了免疫缺陷等病癥時自感染則會慢慢增強導(dǎo)致蟲子在體內(nèi)大量繁殖，嚴(yán)重時出現(xiàn)彌散性感染(Keiseretal2003)。幼蟲在體內(nèi)各器官移行時會擴散細菌和真菌引起腦膜炎，，敗血癥和肺炎等癥狀，引發(fā)重度感染而死亡(Grove 1996, Keiser et al 2003, 李友松等 2003)。

lncRNA分類(RinnandChang2012)
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S852.731

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本文編號：2620903