【摘要】：糞類圓線蟲病是流行于亞熱帶的寄生蟲病之一,危害嚴(yán)重。糞類圓線蟲有著較復(fù)雜的生活史,包括體外自由生活階段和體內(nèi)寄生階段。其中感染性三期幼蟲(iL3)是糞類圓線蟲自由生活階段唯一具有入侵宿主能力的幼蟲,iL3發(fā)育為寄生性雌蟲(pF)的過程不僅僅是一個簡單的發(fā)育過程,更是糞類圓線蟲從自由生活階段進(jìn)入寄生階段一個非常重要的轉(zhuǎn)變過程。研究這兩個時期之間的發(fā)育調(diào)控機制以及iL3的入侵機制對尋找糞類圓線蟲藥物靶標(biāo)和疫苗候選分子具有非常重要的作用。近年來長非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)由于在轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面發(fā)揮重要作用而備受研究者們的關(guān)注。已有的研究證實,lncRNA參與寄生蟲感染和入侵宿主過程中毒力因子的表達(dá),對寄生蟲成功寄生發(fā)揮了重要的作用。并且很多研究表明寄生蟲通過分泌細(xì)胞外囊泡與宿主進(jìn)行信息交流,調(diào)控宿主免疫。因此本研究從lncRNA和細(xì)胞外囊泡兩方面研究iL3和pF之間的發(fā)育調(diào)控機制以及iL3入侵宿主的感染機制,為研究糞類圓線蟲藥物標(biāo)靶和疾病的控制提供新的視角。對糞類圓線蟲lncRNA和細(xì)胞外囊泡研究結(jié)果如下:1.糞類圓線蟲轉(zhuǎn)錄組測序質(zhì)量將2個不同發(fā)育階段的糞類圓線蟲RNA樣品進(jìn)行檢測,RNA樣品檢測合格后,通過去除樣品rRNA、反轉(zhuǎn)錄,第一鏈合成、第二鏈合成、末端修復(fù),3’加A、連接接頭,片段選擇、含U鏈降解等步驟構(gòu)建文庫。文庫質(zhì)控合格后,利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)在糞類圓線蟲中獲得了89%以上的高質(zhì)量測序片段,感染性三期90%、寄生性雌蟲83%以上的測序片段能夠比對到參考基因組上,測序質(zhì)量較高,能夠反映糞類圓線蟲轉(zhuǎn)錄組情況。2.LncRNA的篩選LncRNA為一類長度200 bp的長鏈非編碼RNA,根據(jù)lncRNA的特點進(jìn)行一系列篩選。首先保留x、j、o、u、i以及長度大于等于200 bp的轉(zhuǎn)錄本,篩選得到7126個轉(zhuǎn)錄本。其次,篩選表達(dá)量FPKM1、readscount10以及編碼能力預(yù)測CPC(score0)和CNCI(score0)都注釋為非編碼的轉(zhuǎn)錄本,最后取其交集獲得可信較高的lncRNA 1206條。3.LncRNA特征分析對篩選出來的lncRNA進(jìn)行分類,并對其長度分布和外顯子個數(shù)等基本特征進(jìn)行分析。根據(jù)其在基因組上的位置,糞類圓線蟲lncRNA可分為4類,其中497個基因間長鏈非編碼RNA,17個內(nèi)含子lncRNA,586個反義lncRNA和106個正義lncRNA。大多數(shù)(41%)lncRNA為基因間lncRNA,這與大多數(shù)報道的研究結(jié)果一致�；蚪Y(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)大多數(shù)lncRNA(79%)含有兩個外顯子,只有約1%的lncRNA外顯子數(shù)目大于6個。相比于mRNA,lncRNA含有較少的外顯子。lncRNA長度分布范圍200 nt至3000 nt以上,其中61%lncRNA長度在1500 nt以下,表明大部分的lncRNA的序列長度小于蛋白編碼基因的長度。4.LncRNA功能分析通過cis和trans方式對lncRNA的功能進(jìn)行分析,KEGG數(shù)據(jù)庫功能注釋發(fā)現(xiàn)糞類圓線蟲lncRNA的靶基因可能參與了信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)運和代謝等多個生物學(xué)過程。5.差異表達(dá)lncRNA qRT-PCR驗證分析發(fā)現(xiàn)兩個不同發(fā)育階段共有635個差異lncRNA,其中309個lncRNA是在感染性三期中下調(diào)表達(dá),326個lncRNA在寄生性雌蟲中上調(diào)表達(dá)。根據(jù)lncRNA差異分析結(jié)果,從中挑選出8個在兩個時期具有差異表達(dá)的lncRNA基因進(jìn)行熒光定量PCR實驗,分析不同發(fā)育時期lncRNA的表達(dá)差異。結(jié)果顯示8個lncRNA的表達(dá)趨勢和利用RNA-seq及生物信息學(xué)方法計算出來的表達(dá)量一致,證明本次數(shù)據(jù)分析的準(zhǔn)確性。這些工作為今后研究糞類圓線蟲lncRNA分子功能奠定了基礎(chǔ)。6.糞類圓線蟲感染性三期細(xì)胞外囊泡的研究本研究從糞類圓線蟲感染性三期幼蟲(iL3)體外培養(yǎng)上清中分離細(xì)胞外囊泡并進(jìn)行鑒定。首先,確立收集、純化糞類圓線蟲iL3的方法,建立在體外培養(yǎng)條件,之后收集糞類圓線蟲體外培養(yǎng)20-24 h的上清液,用超速離心法分離出細(xì)胞外囊泡。通過透射電鏡(Transmission Electron Microscopy,TEM)觀察磷鎢酸負(fù)染的細(xì)胞外囊泡,可見直徑約為100-200 nm的典型杯托狀囊泡結(jié)構(gòu),對糞類圓線蟲細(xì)胞外囊泡總蛋白進(jìn)行質(zhì)譜鑒定,比對Uniprot蛋白數(shù)據(jù)庫,共有17種蛋白被鑒定,其中包括細(xì)胞外囊泡標(biāo)志性蛋白延伸因子。綜上所述,通過對糞類圓線蟲lncRNA和細(xì)胞外囊泡的研究,不僅對糞類圓線蟲lncRNA和細(xì)胞外囊泡的研究提供全新的認(rèn)識,并可為將來篩選糞類圓線蟲病的分子標(biāo)記奠定理論基礎(chǔ)。
【圖文】：

華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2019 屆碩士研究生畢業(yè)論文（autoinfectivelarve,L3a） (圖 1-1)。患者免疫力較強時，體內(nèi)維持一個非常低的自感染長期隱形感染。當(dāng)宿主免疫力降低或患了免疫缺陷等病癥時自感染則會慢慢增強導(dǎo)致蟲子在體內(nèi)大量繁殖，嚴(yán)重時出現(xiàn)彌散性感染(Keiseretal2003)。幼蟲在體內(nèi)各器官移行時會擴(kuò)散細(xì)菌和真菌引起腦膜炎，，敗血癥和肺炎等癥狀，引發(fā)重度感染而死亡(Grove 1996, Keiser et al 2003, 李友松等 2003)。

lncRNA分類(RinnandChang2012)
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S852.731

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本文編號：2620903