【摘要】：20世紀60年代在威斯康辛州的火雞雞體內(nèi)分離出H9N2亞型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)以來,該病毒已經(jīng)在世界范圍內(nèi)傳播。為控制H9N2亞型禽流感病毒的傳播,中國內(nèi)地已廣泛實施H9N2亞型禽流感病毒疫苗接種計劃。雖然這項免疫計劃有效地減少了 H9N2亞型禽流感病毒對雞群造成的經(jīng)濟損失,但它并未阻止H9N2亞型禽流感病毒在中國大部分地區(qū)的傳播。為了研究H9N2亞型禽流感病毒的演化,早前本實驗室已經(jīng)在雞胚中對H9N2亞型禽流感病毒進行連續(xù)傳代,另外也對混合的H9N2亞型禽流感病毒在SPF雞體內(nèi)連續(xù)傳代進行了相關(guān)研究,觀察到傳代病毒在抗原性和致病性等方面的變化。為了減少混合病毒對研究結(jié)果的干擾,探究病毒在每只雞個體內(nèi)傳代后的變異情況,在本試驗中我們選擇在疫苗抗體選擇壓下的雞體中進行一對一單傳的傳代模式,即以A/Chicken/Shanghai/F/98(H9N2,F/98)禽流感病毒為研究對象,將F/98株病毒在有和沒有同源疫苗抗體選擇壓力下的SPF雞體內(nèi)連續(xù)一對一傳代,通過HI試驗和分子生物學(xué)等技術(shù)分析所得的傳代病毒的抗原漂移、遺傳進化及其病毒毒力的變化情況,為禽流感的疫苗防治工作提供新的理論基礎(chǔ)。1.F/98株分別在有和沒有疫苗抗體選擇壓下的雞體內(nèi)的連續(xù)傳代及其抗原性和雞胚感染力分析將6只21日齡的SPF雞分為有疫苗抗體選擇壓傳代組(V)和無疫苗抗體選擇壓傳代組(N)兩組,每組各三只。V組建立三個獨立傳代系列V1、V2和V3,用F/98株油乳劑滅活疫苗分別經(jīng)肌肉和皮下注射免疫,免疫后待血清中的抗體滴度HI值為24時,進行感染實驗;N組建立三個獨立傳代系列N1、N2和N3,直接進行感染實驗。所有V組和N組的第一代傳代系列均用同一批次收集的F/98株的病毒尿囊液,將病毒按照106 EID50/0.2mL的劑量分別對SPF雞進行感染,感染途徑為滴鼻、點眼和灌喉。感染后3d分別取各個傳代系列實驗雞的肺和氣管,分別制備四抗PBS的組織研磨液,并置于-70℃凍存?zhèn)溆?此為第一代有和沒有疫苗抗體選擇壓下傳代的組織均漿液。接著取6只21日齡的SPF雞,按上述同樣方法分組,以此方法類推,共進行到第9代次的傳代系列。取第5代次和第9代次的肺和氣管的組織勻漿液分別接種10日齡雞胚,分離獲得在有和沒有疫苗抗體選擇壓的雞中傳代的病毒尿囊液;將分離收集的病毒尿囊液與母本病毒F/98株的陽性多抗血清進行HI實驗。結(jié)果顯示,與母本病毒F/98株的HI效價相比,有疫苗抗體選擇壓下第5代次肺組織分離的傳代病毒(簡稱V5L)、無疫苗抗體選擇壓下第5代次肺組織分離的傳代病毒(簡稱N5L)、有疫苗抗體選擇壓下第5代次氣管分離的傳代病毒(簡稱V5T)和無疫苗抗體選擇壓下第5代次氣管分離的傳代病毒(簡稱N5T)的HI均沒有明顯差異;然而,有疫苗抗體選擇壓下第9代次肺組織分離的傳代病毒(簡稱V9L)和無疫苗抗體選擇壓下第9代次肺組織分離的傳代病毒(簡稱N9L)的HI效價下降了 8倍。同時,有疫苗抗體選擇壓下第9代次氣管分離的傳代病毒(簡稱V9T)和無疫苗抗體選擇壓下第9代次氣管分離的傳代病毒(簡稱N9T)的HI效價下降了 16倍。這些結(jié)果表明,經(jīng)過5個代次的傳代后,相比母本病毒F/98株,傳代病毒的抗原性基本沒有變異;而經(jīng)過9個代次的傳代后,與母本病毒F/98株相比,傳代病毒抗原性均發(fā)生了明顯的變異。第9代次的傳代病毒在有和沒有疫苗抗體選擇壓下的適應(yīng)性不僅包括抗原性變化,而且還表現(xiàn)出對雞胚感染力和致死力的變化。V9L和V9T病毒的EID50是母本病毒F/98株的1.77倍,二者無明顯差異;而N9L和N9T病毒的EID50分別是母本病毒F/98株的25.4倍和17.7倍,傳代病毒的雞胚感染力顯著提高。此外,與F/98株相比,V9L和V9T病毒喪失了致死雞胚的能力,而N9L和N9T病毒的ELD50僅提高了 0.77倍,與母本病毒無明顯差異。綜上所述,沒有疫苗抗體選擇壓下的傳代病毒對雞胚的感染力相比母本病毒有了顯著提高,而有疫苗抗體選擇壓下的傳代病毒對雞胚的感染力相比母本病毒變化不大,但喪失了致死雞胚的能力。2.F/98株病毒的第9代次傳代病毒的基因分析將第9代次的優(yōu)勢傳代病毒與親本病毒F/98株相比,除了病毒的抗原性發(fā)生改變,各基因片段的部分氨基酸也發(fā)生了變化。與母本病毒相比,V9L病毒共計發(fā)生了 13個氨基酸突變,其中 PB2 基因 5 個(T296K,A322E,R327K,H366Q,Y369S)、PB1 基因 2個(T251V,A669G)、HA 基因 2 個(K131R,A198V)、NP 基因 1 個(A100R)、NA基因1個(C385T)、M基因2個(P154A,A246Q);V9T病毒共計發(fā)生了 11個氨基酸突變,其中 PB2 基因 4 個(A322E,R327K,H366Q,Y369S)、PA 基因 1 個(S148H)、HA 基因 2 個(A198V,Q234L)、NP 基因 1 個(G45T)、NA 基因 1 個(C385T)、M基因2個(P154A,A246Q);N9L病毒共計發(fā)生了 20個氨基酸突變,其中PB2基因6個(T138A,T296K,I298Q,R327K,Y369S,E526R)、PB1 基因 1 個(T348A)、PA基因 4 個(S148H,L336M,K544M,S640K)、HA 基因 2 個(N167G,N285S)、NP基因 3 個(G52A,D65L,L187G)、M 基因 2 個(H23I,T331A)、NS 基因 2 個(S81L,H85S);N9T病毒共計發(fā)生了 18個氨基酸突變,其中PB2基因5個(T296K,I298Q,R327K,Y369S,E526R)、PB1 基因 1 個(T348A)、PA 基因 2 個(S148H,L336M)、HA 基因 3 個(A198V,Q234L,N285S)、NP 基因 4 個(G52A,S65L,L187G,G419V)、M基因1個(H23I)、NS基因2個(S81L,H85S);此外,V9L和V9T病毒的NA蛋白在67-76位缺失10個氨基酸(A67-76)。這些結(jié)果顯示,抗體選擇壓使病毒的NA蛋白發(fā)生67-76位氨基酸缺失;抗體選擇壓下的傳代病毒氨基酸突變數(shù)量明顯少于沒有抗體選擇壓下的傳代病毒氨基酸突變數(shù)量;肺組織分離到的傳代病毒氨基酸突變數(shù)量略多于相同傳代條件下氣管中分離到的傳代病毒氨基酸突變數(shù)量。綜上所述,在有和沒有疫苗抗體選擇壓下連續(xù)傳代9代次,H9N2亞型禽流感病毒F/98株的抗原性都發(fā)生了變異;抗體選擇壓使F/98株失去致死雞胚能力,NA蛋白發(fā)生67-76位氨基酸缺失,使F/98株基因組突變數(shù)顯著少于無抗體選擇壓下傳代的病毒。這些結(jié)果表明,疫苗抗體選擇壓力對H9N2亞型禽流感病毒的進化及其一些生物學(xué)特性的變化具有重要作用。
【圖文】：

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【學(xué)位授予單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S852.65

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本文編號：2618060