【摘要】：斷奶應激可導致仔豬易受病原菌感染,從而引起腹瀉甚至死亡。產腸毒性大腸桿菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)主要包括K88、K99、987P以及F4,它們是引起仔豬斷奶后腹瀉的典型菌株。因此,預防和治療ETEC感染的方法倍受大眾關注。適配體主要是通過指數(shù)富集系統(tǒng)進化技術篩選出來的一段對靶標具有高親和力和特異性的ssDNA或RNA。本文以豬腸上皮細胞系IPEC-J2為體外模型,發(fā)現(xiàn)K88-Apt 37(ETEC K88的菌毛適配體)和K88-Apt A04(ETEC K88的菌體適配體)能有效地減少病原菌ETEC K88對腸上皮細胞的黏附,從而減少隨后的炎癥反應。我們的研究工作主要包括以下幾點:(1)將仔豬腸道上皮細胞系IPEC-J2用作體外模型以評估適配體對ETEC K88的黏附和細胞毒性作用的影響,確定了ETEC K88-IPEC-J2互作模型的基礎濃度(10 MOI)以及作用時間。在此作用條件下,評估適配體在黏附抑制,黏附競爭,黏附置換三種作用模式下對此互作模型的影響。結果顯示,適配體在三種互作模型下都能減少細菌對細胞的黏附。(2)為更好地觀察適配體對ETEC K88黏附細胞的作用效果,我們構建了熒光質粒并導入ETEC K88中使細菌ETEC K88成功表達EGFP熒光蛋白。流式細胞儀分析以及熒光顯微鏡觀察以進一步探究適配體對三種互作模型的作用效果,發(fā)現(xiàn)K88-Apt 37與靶標菌的親和力較高,K88-Apt A04造成的細胞毒性較小,低濃度的K88-Apt 37或高濃度的K88-Apt A04用作抑制劑來減少腸道上皮細胞感染的效果更好。除此之外,互作模型中適配體對減少細菌造成的細胞凋亡的效果基本呈現(xiàn)黏附抑制黏附競爭黏附置換的趨勢,提示將適配體作為預防性藥物在病原菌感染之前使用可能效果更好。(3)使用熒光定量PCR和ELISA試劑盒分析了兩種適配體分別對ETEC K88-IPEC-J2互作模型中的IPEC-J2細胞的主要炎癥因子的mRNA和蛋白表達情況,探討適配體幫助IPEC-J2細胞免受ETEC K88攻擊損傷的分子機制。結果表明,適配體的存在能下調ETEC K88引起的IPEC-J2細胞中TNF-α的表達,也能下調由ETEC K88引起的細胞中模式識別受體(PRR)和促炎細胞因子的mRNA的表達,說明適配體能降低致病菌攻擊引起的炎癥因子的分泌�？傊�,適配體K88-Apt 37和K88-Apt A04能通過與細菌相互作用從而減少細菌對腸上皮細胞的黏附,進而減少細菌造成的細胞毒性與炎癥反應,保護腸上皮細胞免受ETEC K88攻擊,對大腸桿菌ETEC K88引起的仔豬腹瀉的防治具有重要作用,也為其他致病微生物所引起的腹瀉的治療提供了新思路。
【圖文】：

附于宿主的小腸上皮細胞故而又稱黏附因子(Adhesion Factor)或定居因子(Colonizing Factor)。ETEC F4菌毛在電子顯微鏡下呈纖細的絨毛絲狀，長約0.5~3μm，，直徑為2~5 nm（圖1-1），以多聚蛋白的形式遍布在菌體的表面[11]。ETEC進入宿主細胞后，首先黏附于小腸上皮細胞以避免由于腸道的蠕動和腸液的沖刷而將其排出體外，接著在腸內定居并繁殖，進而誘發(fā)機體并發(fā)感染。菌毛的黏附

使A亞基能進入靶細胞以產生毒素活性[14]（圖1-2）。圖 1-2 產腸毒素大腸桿菌的熱敏腸毒素 LT 導致動物腹瀉的作用機制[15]Fig.1-2 Classic mechanisms of action of heat-labile enterotoxin (LT) produced by ETEC（2）熱穩(wěn)定性腸毒素(ST)
【學位授予單位】：湖南師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S858.28

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1 程學慧,王R

本文編號：2617896