【摘要】：鴨脂肪細(xì)胞的形成與脂肪沉積屬于復(fù)雜性狀,一方面脂肪組織在維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)具有重要作用,另一方面脂肪異位過度沉積與飼料轉(zhuǎn)化率、機(jī)體疾病密切相關(guān)。另外,肌肉與皮下、腹部組織中對脂肪含量的需求也截然不同,這些都是行業(yè)亟待解決的關(guān)鍵問題。本研究以脂肪沉積存在顯著差異的櫻桃谷鴨、鳳頭鴨及其F2資源群體為對象,從群體表型、全基因組、轉(zhuǎn)錄組水平等篩選出影響鴨脂肪細(xì)胞形成與脂肪沉積的候選功能基因,并整合全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)與RNA組學(xué)數(shù)據(jù),利用聯(lián)合薈萃分析的方法,進(jìn)一步鑒定出與脂肪生成與沉積相關(guān)的關(guān)鍵功能基因,旨在篩選出一批影響鴨脂肪生成與沉積的候選功能基因,為全面揭示不同鴨品種、不同部位脂肪生成與沉積的分子調(diào)控機(jī)制以及降低脂肪異位沉積造成的危害提供參考依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:1.鴨原代前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)體系建立與成脂能力研究以20胚齡(E20)櫻桃谷鴨脂肪組織為材料,膠原酶消化分離培養(yǎng)鴨原代前脂肪細(xì)胞。由于家禽的脂肪細(xì)胞自身不能合成脂肪酸,因此需要添加外源脂肪酸刺激成脂,本研究選用油酸作為鴨原代前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)劑,在10μg/μL胰島素,1μm/LDEX,0.5mmol/L IBMX,1μM羅格列酮組成的基礎(chǔ)配方中添加不同濃度油酸(100μM,300μM,600μM),來探究油酸在鴨前脂肪細(xì)胞成脂過程中的作用。通過表型的定性觀察和定量測定,發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)2天后,視野中發(fā)現(xiàn)形似亮斑的小脂滴,油紅O染色為紅色的亮斑,誘導(dǎo)4-6天后,小脂滴逐漸累積,體積從小到大,梭形的前脂肪細(xì)胞開始回縮,誘導(dǎo)8天后,前脂肪細(xì)胞分化為圓形的脂肪細(xì)胞,細(xì)胞質(zhì)被大量的脂滴填充,細(xì)胞核位于一側(cè),視野中的前脂肪細(xì)胞發(fā)育成橢圓形或圓形成熟脂肪細(xì)胞,所有細(xì)胞幾乎都染成紅色,而作為脂滴主要成分的甘油三酯含量隨著誘導(dǎo)時間的增加逐漸升高。同時,發(fā)現(xiàn)在油酸添加量為300μM時,前脂肪細(xì)胞的成脂量最高,且在一定范圍內(nèi),隨著油酸濃度的增加,成脂量逐漸增加,增加到600μM時,油酸對成脂存在一定程度的抑制作用。根據(jù)誘導(dǎo)效率和表型檢測,最終建立了最佳誘導(dǎo)體系:10μg/uL胰島素,1μm/L DEX,0.5mmol/L IBMX,1μM羅格列酮以及300μM油酸,成功將鴨前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)為脂肪細(xì)胞。生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)大體型肉鴨品種—櫻桃谷鴨與小體型鴨品種—鳳頭鴨相比,無論是在肌內(nèi)脂肪、腹脂含量或者皮下脂肪含量上均存在顯著差異,推斷其前脂肪細(xì)胞的成脂能力可能存在差異。通過分離櫻桃谷鴨與鳳頭鴨胚胎20天(E20)脂肪組織的前脂肪細(xì)胞,經(jīng)過3天體外誘導(dǎo)后,通過CCK-8檢測發(fā)現(xiàn)櫻桃谷鴨在前脂肪細(xì)胞的增殖能力以及脂肪細(xì)胞中TG含量均顯著高于鳳頭鴨,表明了大體型的櫻桃谷鴨具有較強(qiáng)的脂肪生成能力。2.全轉(zhuǎn)錄組測序篩選鴨脂肪細(xì)胞成脂關(guān)鍵功能基因為篩選鴨脂肪細(xì)胞成脂關(guān)鍵功能基因,以20胚齡(E20)櫻桃谷鴨原代脂肪前體細(xì)胞為素材,在上述前脂肪細(xì)胞的體外分離與誘導(dǎo)模型的基礎(chǔ)上,對前脂肪細(xì)胞與誘導(dǎo)72h后的脂肪細(xì)胞進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組測序,分析mRNA,miRNA,lncRNA與circRNA的差異。結(jié)果表明,與前脂肪細(xì)胞相比,誘導(dǎo)72h后的脂肪細(xì)胞中共篩選到4702個差異表達(dá)的mRNA(2606個基因顯著上調(diào),2096個基因顯著下調(diào)),839個差異表達(dá)的lncRNA(58個lncRNA顯著上調(diào),781個lncRNA顯著下調(diào)),141個差異表達(dá)的circRNA(66個circRNA顯著上調(diào),75個circRNA顯著下調(diào)),59個差異表達(dá)的miRNA(32個miRNA顯著上調(diào),27個miRNA顯著下調(diào))。通過GO與KEGG功能注釋發(fā)現(xiàn),差異基因大量地富集在與脂肪有關(guān)的不飽和脂肪酸、脂肪酸的生物合成以及細(xì)胞代謝等過程中,通路分析的結(jié)果顯示,差異表達(dá)基因顯著富集在脂肪酸代謝通路,類固醇的生物合成,PPARγ信號通路等。采用RT-qPCR對9個mRNA,7個lncRNA,7個circRNA,15個miRNA在櫻桃谷鴨樣本上進(jìn)行驗證,發(fā)現(xiàn)表達(dá)趨勢、差異顯著性與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果均一致,證實了轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的可靠性。通過生物信息學(xué)預(yù)測了差異表達(dá)lncRNA與circRNA的靶向miRNA,構(gòu)建了lncRNA/circRNA-miRNA-mRNA的競爭內(nèi)源調(diào)控機(jī)制,其中,起關(guān)鍵的作用包括XLOC_014103-miR-181b-5p-MMP13,XLOC_001895-miR-122-5P-KLF2,circ_0003172-miR-15c-5p-LYZ,circ_0009143-miR-206-FAS和circ_0003172-miR-219b-KF2 等,為進(jìn)一步研究鴨脂肪細(xì)胞中的成脂機(jī)制奠定了基礎(chǔ),篩選出與成脂過程中的關(guān)鍵RNA。在上述初步篩選的基礎(chǔ)上,我們將鴨脂肪細(xì)胞成脂關(guān)鍵功能基因,包括DLK1,PPARγ,FAS,C/EBPα,F B44PL和進(jìn)行細(xì)胞水平的功能驗證,發(fā)現(xiàn)隨著前脂肪細(xì)胞的分化與脂肪形成的過程中,DLLK1作為前脂肪細(xì)胞因子在前脂肪細(xì)胞中表達(dá)量最高,伴隨著誘導(dǎo)過程其表達(dá)量逐漸下降,到誘導(dǎo)10天后,DLK1的表達(dá)量最低,幾乎不表達(dá)。FABP4和LPL基因的表達(dá)量最高峰出現(xiàn)在誘導(dǎo)10天后,而在誘導(dǎo)8天后,C/EBPα和FAS的表達(dá)量達(dá)到最高點。隨著誘導(dǎo)分化時間的延長,PPPRγ的表達(dá)逐漸增加,最高峰在誘導(dǎo)后的第6天。以上表明DLK1,PPARγ,FAS,C/EBPα,FABP 和LPL等基因在脂肪形成中均發(fā)揮重要作用。為了進(jìn)一步研究PPARγ這一影響家禽脂肪性狀的明星基因,同時以上測序數(shù)據(jù)與細(xì)胞水平驗證結(jié)果,也發(fā)現(xiàn)PPARγ在鴨脂肪形成中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。因此,我們篩選出對PPARγ特異性干擾作用的siRNA進(jìn)行了敲低實驗。干擾PPARγ48h后,發(fā)現(xiàn)原代脂肪細(xì)胞TG含量下降,同時相關(guān)成脂基因的mRNA表達(dá)水平也表現(xiàn)為下降,其中,轉(zhuǎn)錄因子C/EBPα與FABP4基因的表達(dá)水平均下降但差異不顯著,而LPL的表達(dá)水平顯著下降(P0.05)。表明PPARγ確實能夠影響鴨脂肪形成,并發(fā)揮關(guān)鍵作用,是重要的候選基因之一。在上述試驗中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)櫻桃谷鴨與鳳頭鴨的成脂能力存在差異,為探明不同品種的成脂差異的分子機(jī)制,我們對櫻桃谷鴨與鳳頭鴨的的差異miRNA和關(guān)鍵mRNA進(jìn)行了比較分析。首先從誘導(dǎo)72h后的鳳頭鴨脂肪細(xì)胞與前脂肪細(xì)胞比較中篩選出影響鳳頭鴨成脂的關(guān)鍵miRNA,結(jié)果發(fā)現(xiàn)差異顯著的miRNA有105個(50個miRNA顯著上調(diào),55個miRNA顯著下調(diào))。選擇其中7個miRNA在鳳頭鴨原代細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)水平驗證,結(jié)果與測序結(jié)果一致。在櫻桃谷鴨與鳳頭鴨中,共有37個miRNA是櫻桃谷鴨與鳳頭鴨所共有的,且在這37個交集miRNA中,有31個在2個品種中的表達(dá)趨勢是一致的,推測這些miRNA可能在脂肪的生成過程中發(fā)揮不可缺少的作用;同時發(fā)現(xiàn)有22個miRNA在櫻桃谷鴨成脂過程特異表達(dá),68個miRNA在鳳頭鴨的成脂過程特異性的發(fā)揮作用,通過靶基因預(yù)測后,我們發(fā)現(xiàn)了 419個特異性在櫻桃谷鴨成脂過程表達(dá)的基因,顯著富集到了包括脂肪酸的延伸,生成和代謝等過程。進(jìn)一步對其中的成脂關(guān)鍵基因:PPARγ,FAS,C/EBPα,FABP4和LPL等在2個品種上進(jìn)行驗證,發(fā)現(xiàn)除LPL外,誘導(dǎo)72h后櫻桃谷鴨的脂肪細(xì)胞的4個基因表達(dá)量均顯著高于鳳頭鴨,再次在分子水平上驗證了大體型的櫻桃谷鴨脂肪形成沉積能力高于鳳頭鴨。3.全基因組關(guān)聯(lián)分析鑒定肌內(nèi)脂肪與腹脂沉積候選基因為了進(jìn)一步鑒定出鴨脂肪形成的關(guān)鍵基因,在細(xì)胞水平研究的基礎(chǔ)上,我們從個體水平通過全基因組關(guān)聯(lián)分析影響鴨脂肪形成沉積的關(guān)鍵基因或標(biāo)記,以期進(jìn)行生產(chǎn)應(yīng)用。構(gòu)建了櫻桃谷鴨(♂)×鳳頭鴨(早)雜交F2資源群體共304只并進(jìn)行樣品采集,采血并測定腹脂重與胸肌肌內(nèi)脂肪含量,提取DNA通過10×全基因組重測序,結(jié)合表型值進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果顯示,肌內(nèi)脂肪范圍為1.260%～1.503%,均值為1.387%,腹脂重范圍為4g～51g,均值為27.622g,性狀表型值符合正態(tài)分布,通過Bonferroni多重檢驗校正法確定Pvalue的顯著性閾值為5(-log10P)時,對胸肌肌內(nèi)脂肪含量性狀共定位到14個極顯著的SNPs,根據(jù)NCBI,Ensembl,KEGG,Uniprot,GeneCards等數(shù)據(jù)庫信息,利用生物信息學(xué)和比較基因組的方法,對顯著位點的SNP周圍1個LD(20kb)距離的基因進(jìn)行功能注釋,發(fā)現(xiàn)了包括BARHL2,SLC22A16,THBD,OGDH,CD93,Ctgf等共25個基因,這些基因功能主要涉及DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性,轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族,神經(jīng)元遷移,磷酸肌醇酯酶等,具有激酶活性,參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等多個方面。腹脂重性狀定位到12個極顯著SNPs,注釋后共包含MICALL1,GALR3,SOX10,EIF3L,POLR2F等48個基因,將所有篩選的脂肪相關(guān)基因進(jìn)行功能注釋后,發(fā)現(xiàn)包括PGDFB和ATF4等顯著富集到了 MAPK以及激素代謝等信號通路。MAPK信號通路同時在肌內(nèi)脂肪與腹脂重性狀中發(fā)揮調(diào)控作用,同時,由LAMA4參與的PI3K-AKT通路通過糖酵解和糖質(zhì)新生等過程調(diào)控肌內(nèi)脂肪的生成與代謝,而由PDGFB與ATF4通過SOS信號通路與Erk1/2作用,對PPARγ通路的抑制作用調(diào)控脂肪沉積。4.GWAS與轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合分析鑒定鴨脂肪形成沉積基因整合轉(zhuǎn)錄組測序與全基因關(guān)聯(lián)分析的結(jié)果發(fā)現(xiàn),全基因組關(guān)聯(lián)分析的26個SNPs中的73個基因,與轉(zhuǎn)錄組篩選的4702個差異基因進(jìn)行聯(lián)合分析后發(fā)現(xiàn),共存在18個交集基因(LAMA4,SYNJ1,CD164,CDK19,SLC22A16,RPF2,GTF3C6,AMD1,SSTR4,CARD11,SH3BP1,GCAT,MICALL1,POLR2F,JOSD1,RPL3,PDGFB,MGAT3),通過功能注釋與通路分析,篩選到影響鴨脂肪形成與沉積的關(guān)鍵基因PDGFB,MGAT3,LAMA4,SLC22A16,AMD1,CD164等,將篩選出的基因進(jìn)行通路分析后,發(fā)現(xiàn)PDGFB與mTOR信號通路密切相關(guān),因此提出以下假說,PDGFB可能通過啟動PI3K/Akt信號通路對mTOR信號通路產(chǎn)生抑制作用,進(jìn)一步與PPARγ信號通路的發(fā)生作用,與mRNA,miRNA,lncRNA和circRNA等共同調(diào)控脂肪的生成。綜上所述,鴨脂肪形成沉積的過程是復(fù)雜的,PDGFB,MGAT3,LAMFB,SLC22A16,AMD1,CD164在全基因組SNP水平和轉(zhuǎn)錄水平對鴨脂肪形成沉積具有較大效應(yīng),同時表明BARHL2,ATF4在全基因組SNP水平,MMP13,KLF 等基因在轉(zhuǎn)錄水平可能是影響脂肪的形成與沉積關(guān)鍵候選基因。
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S834

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