【摘要】：新城疫病毒屬于單分子負(fù)鏈RNA目副黏病毒科副黏病毒亞科禽腮腺炎病毒或禽副黏病毒屬成員,可引起具有致命性和高度傳染性的新城疫疾病。自然感染的禽類動(dòng)物可導(dǎo)致其呼吸系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)以及神經(jīng)系統(tǒng)的損傷。目前,新城疫病毒的易感動(dòng)物已呈現(xiàn)多樣化,不再局限于禽類動(dòng)物,水貂也受到該病毒的感染。新城疫病毒對(duì)水貂養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)利益損失,成為危害我國水貂養(yǎng)殖業(yè)的重要疫病之一。雖然已有不少學(xué)者對(duì)禽類動(dòng)物新城疫病毒進(jìn)行了研究,但關(guān)于水貂源新城疫病毒的生物學(xué)特性及流行病學(xué)等方面,仍有很多問題亟待解決。鑒于目前新城疫病毒的檢測(cè)方法具有很大的局限性,且主要針對(duì)禽類動(dòng)物,因此急需建立一種簡捷高效的檢測(cè)方法對(duì)水貂進(jìn)行全面有效的診斷和監(jiān)控,以加強(qiáng)水貂養(yǎng)殖業(yè)的疫病防控,對(duì)水貂養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展具有重要的作用。本研究以黑龍江省某水貂養(yǎng)殖場(chǎng)的自然發(fā)病水貂為研究對(duì)象,通過臨床癥狀觀察、病毒分離鑒定、動(dòng)物回歸試驗(yàn)及分子生物學(xué)檢測(cè)等方法,證明水貂的發(fā)病病原是水貂源新城疫病毒,且為強(qiáng)毒株毒力。這是我國首次從水貂體內(nèi)成功分離得到的一株水貂源新城疫病毒分離株,命名為mNDV-01-HLJ毒株。隨后,成功對(duì)mNDV-01-HLJ毒株進(jìn)行全基因組克隆測(cè)序,獲得15192 bp的全基因組序列,并對(duì)其序列和編碼蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析以及構(gòu)建分子遺傳進(jìn)化樹,結(jié)果表明分離病毒屬于Class Ⅱ基因Ⅶ型毒株。HN蛋白是新城疫病毒的主要囊膜糖蛋白,HN基因的研究會(huì)對(duì)新城疫病毒的生物學(xué)特性及診斷預(yù)防等方面研究具有重要指導(dǎo)作用。本研究選取HN蛋白胞外區(qū)抗原性較好的區(qū)域設(shè)計(jì)引物,成功擴(kuò)增出長為1578 bp的目的基因,克隆至表達(dá)載體pGEX-6P-1中,構(gòu)建重組表達(dá)載體pGEX-mNDV-HN,將陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)BL21中,通過IPTG誘導(dǎo)表達(dá),獲得可溶性表達(dá)的目的蛋白83 kDa,且具有良好的免疫原性。最后,以該重組蛋白為診斷抗原建立水貂源新城疫病毒間接ELISA檢測(cè)方法,通過矩陣法優(yōu)化確定其最佳條件,其中抗原包被濃度為200 ng/孔、血清稀釋度為1:80、封閉液底物為5%脫脂乳、二抗工作濃度為1:5000、底物作用時(shí)間為20 min。通過驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,建立的間接ELISA檢測(cè)方法具有更高的特異性和敏感性。綜上所述,本研究成功從水貂體內(nèi)分離出一株新城疫病毒mNDV-01-HLJ毒株,通過克隆測(cè)序獲得了其全基因組序列并進(jìn)行生物信息學(xué)分析;并以截短表達(dá)的pGEX-mNDV-HN蛋白為抗原,建立了水貂源新城疫血清內(nèi)抗體的間接ELISA檢測(cè)方法。本研究將有助于分析中國水貂源新城疫病毒的分子流行情況,了解水貂源新城疫病毒的遺傳規(guī)律,為水貂源新城疫病毒疫苗株的篩選及疾病的診斷奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

）被轉(zhuǎn)錄成信使ＲＮＡ，其將被翻譯成不同的病毒蛋白質(zhì)或ｓｓＲＮＡ邋（邋＋邋），將用作合成逡逑ｓｓＲＮＡ邋（－）的反應(yīng)模板。其后，病毒蛋白和基因組ＲＮＰ將被裝配在宿主細(xì)胞膜的細(xì)胞逡逑質(zhì)內(nèi)部小葉上，并通過萌芽釋放病毒顆粒新的子代，，如圖１－２所示。ＨＮ蛋白的神經(jīng)氨逡逑酸酶可以去除新生病毒顆粒中的唾液酸殘基，從而防止它們結(jié)合并加快病毒在感染組織逡逑內(nèi)的擴(kuò)散。逡逑－２邋－逡逑

－ＡＵＵＣＵＵＵＵＵＵ－５，），逡逑且每個(gè)基因組之間被保守的序列分開（３’－ＧＡＡ－５’），這些順式作用元件控制病毒的復(fù)逡逑制、殼體化和病毒包裝（圖１－３）邋［１８］。逡逑－３邋－逡逑
【學(xué)位授予單位】：東北林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S852.65

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2617411