發(fā)布時(shí)間：2020-04-07 03:32

【摘要】：化膿隱秘桿菌(Trueperella pyogenes,T.pyogenes)是人和多種動(dòng)物的條件性致病菌。T.pyogenes是引起肺炎、乳房炎、子宮內(nèi)膜炎等多種器官和黏膜化膿性感染的重要病原菌之一,嚴(yán)重時(shí)也可導(dǎo)致膿毒敗血癥使動(dòng)物死亡,給養(yǎng)殖業(yè)造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。溶血素(Pyolysin,PLO)是T.pyogenes分泌的一種外毒素,也是唯一一種溶血素。PLO作為膽固醇依賴性溶細(xì)胞素(Cholesterol-dpendent cytolysin,CDCs)家族成員,可以通過(guò)與細(xì)胞膜上的膽固醇結(jié)合形成穿膜孔道而發(fā)揮其溶細(xì)胞效應(yīng)。但PLO在T.pyogenes感染過(guò)程中發(fā)揮的作用尚未完全闡明。本研究首先用T.pyogenes通過(guò)呼吸道接種小鼠。結(jié)果表明,T.pyogenes能在小鼠肺臟內(nèi)增殖并擴(kuò)散到其他器官,最終導(dǎo)致動(dòng)物死亡。Western blot檢測(cè)表明,T.pyogenes感染能夠?qū)е滦∈笃⑴K和肺臟中caspase-3和caspase-9的活化。T.pyogenes和滅活T.pyogenes分別作用小鼠巨噬細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)T.pyogenes能激活caspase-3,而滅活的T.pyogenes不能。上述結(jié)果表明,T.pyogenes感染能導(dǎo)致小鼠細(xì)胞發(fā)生凋亡,而上述效應(yīng)可能與T.pyogenes分泌的外毒素——PLO有關(guān)。隨后本研究將重組PLO(recombinant PLO,rPLO)第238位天冬氨酸(D)替換為精氨酸(R),制備了rPLO D238R。檢測(cè)表明,rPLO D238R溶血活性顯著低于rPLO。對(duì)rPLO D238R的鑒定表明,其結(jié)合細(xì)胞膜的能力與rPLO相似,但在含膽固醇的脂質(zhì)體上形成高分子量寡聚體的能力顯著減弱。透射電子顯微鏡(Transmission Electron Microscope,TEM)觀察發(fā)現(xiàn),rPLO可在細(xì)胞膜上形成典型的穿膜孔道結(jié)構(gòu),而rPLO D238R不能。另外rPLO D238R對(duì)L929和MDBK細(xì)胞的毒性也顯著低于rPLO。上述結(jié)果表明,rPLO的成孔活性和溶細(xì)胞活性與其膜結(jié)合能力和寡聚化能力密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn),rPLO作用小鼠巨噬細(xì)胞后,細(xì)胞中caspase-2/3/6/8/9的活化水平明顯升高;Western blot結(jié)果顯示PLO作用巨噬細(xì)胞后可導(dǎo)致caspase-3/9/12的活化,rPLO D238R和rPLO P499F(本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的另一種rPLO突變體,其與細(xì)胞膜結(jié)合的能力和溶血活性顯著降低)不導(dǎo)致上述現(xiàn)象。上述結(jié)果說(shuō)明,PLO的成孔活性在其誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡的過(guò)程中起關(guān)鍵性作用。Western blot和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明,rPLO作用小鼠巨噬細(xì)胞后,可導(dǎo)致線粒體膜電位(△Ψm)的改變及線粒體中細(xì)胞色素C(Cytochrome C)的釋放,同時(shí)可導(dǎo)致細(xì)胞中活性氧簇(ROS)含量的增加。上述結(jié)果表明,PLO誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞凋亡的過(guò)程與細(xì)胞凋亡的線粒體途徑活化有關(guān)。Z-LEHD-FMK(caspase-9抑制劑)、Z-VAD-FMK(caspase抑制劑)、BAPTA-AM(胞內(nèi)Ca~(2+)螯合劑)和NAC(ROS消除劑)與rPLO共同作用小鼠巨噬細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)上述抑制劑能夠抑制rPLO誘導(dǎo)的caspase-3的活化。上述結(jié)果證明,線粒體途徑參與了PLO導(dǎo)致的小鼠巨噬細(xì)胞凋亡。綜上,本研究證實(shí)了T.pyogenes分泌的PLO能夠通過(guò)激活線粒體途徑導(dǎo)致巨噬細(xì)胞中caspase-3的活化和細(xì)胞凋亡的發(fā)生,且這種能力與PLO結(jié)合細(xì)胞膜并在細(xì)胞膜上寡聚化形成穿膜孔道的能力直接相關(guān)。本研究的結(jié)果為全面理解T.pyogenes感染過(guò)程中PLO發(fā)揮毒力效應(yīng)的機(jī)制提供了部分依據(jù)。
【圖文】：

圖 1-1 CDCs 的成孔機(jī)制[26]Fig. 1-1 The CDC pore-forming mechanism CDCs 的主要成員之一，具有 CDCs 成員典型的成孔特征。除此征。如圖 1-3，根據(jù)對(duì) CDCs 家族成員的同源性分析得出，PLO的成員，氨基酸序列與其它 CDCs 的同源性為 31-41%[33]。與部分 在細(xì)胞膜上穿膜成孔無(wú)需硫醇激活[34]，，并且 PLO 的溶血活性對(duì)感[35-36]。

圖 1-1 CDCs 的成孔機(jī)制[26]Fig. 1-1 The CDC pore-forming mechanism白是 CDCs 的主要成員之一，具有 CDCs 成員典型的成孔特征的特征。如圖 1-3，根據(jù)對(duì) CDCs 家族成員的同源性分析得出最大的成員，氨基酸序列與其它 CDCs 的同源性為 31-41%[33]。PLO 在細(xì)胞膜上穿膜成孔無(wú)需硫醇激活[34]，并且 PLO 的溶血不敏感[35-36]。
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S852.4

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2617393