【摘要】：雄性生殖干細(xì)胞(male germ stem cell,mGSCs),同樣被稱作精原干細(xì)胞(spermatogonial stem cells,SSCs)是位于睪丸曲細(xì)精管基底膜上,既能通過(guò)自我更新維持自身群體數(shù)量的穩(wěn)定,又能在體內(nèi)定向分化并最終形成精子的一類成體干細(xì)胞。雄性生殖干細(xì)胞可以作為研究精子發(fā)生、減數(shù)分裂調(diào)控和細(xì)胞重編程的一個(gè)理想體外模型。Double sex and mab-3 related transcription factor 1(DMRT1)基因編碼的蛋白質(zhì)包含一個(gè)double sex/mab-3結(jié)構(gòu)域,無(wú)論是在脊椎動(dòng)物或者無(wú)脊椎動(dòng)物中,這個(gè)最保守的結(jié)構(gòu)域都會(huì)參與個(gè)體的性別決定過(guò)程。除此之外,DMRT1參與雄性生殖干細(xì)胞的損傷修復(fù)、抑制睪丸腫瘤、維持雄性生殖干細(xì)胞有絲分裂與減數(shù)分裂的平衡并且調(diào)控雄性生殖干細(xì)胞的多能性。因此,探究DMRT1在雄性生殖干細(xì)胞中的功能機(jī)制,可以為提高動(dòng)物遺傳育種、動(dòng)物疾病模型和物種保護(hù)提供理論指導(dǎo)。在本研究中我們首次研究了DMRT1對(duì)山羊雄性生殖干細(xì)胞分化和自我更新過(guò)程中的影響,以及DMRT1在睪丸生殖免疫中發(fā)揮的功能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:1.DMRT1基因在哺乳動(dòng)物中廣泛存在且不同物種中序列高度保守,多序列比對(duì)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)6種哺乳動(dòng)物的DMRT1基因序列一致性達(dá)到了86.42%。對(duì)于其核心結(jié)構(gòu)域DM結(jié)構(gòu)域分析表明,不同物種的氨基酸序列基本一致,說(shuō)明DM結(jié)構(gòu)域在不同物種中同樣具有高度保守性。為了探究DMRT1在山羊不同組織的表達(dá)情況,免疫熒光染色結(jié)果表明DMRT1在山羊睪丸中特異表達(dá)。染色及定量PCR進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)DMRT1在1月齡山羊睪丸的表達(dá)量很低,3月齡睪丸起始減數(shù)分裂后DMRT1表達(dá)明顯上調(diào),至個(gè)體成熟其表達(dá)水平趨于穩(wěn)定。其次,利用免疫熒光共染色揭示了DMRT1主要定位在未分化和分化中的雄性生殖干細(xì)胞中,但是在啟動(dòng)減數(shù)分裂的精母細(xì)胞中卻沒有表達(dá)。根據(jù)以上結(jié)果,我們認(rèn)為DMRT1主要在雄性生殖干細(xì)胞中發(fā)揮功能,對(duì)于mGSCs的分化和增殖發(fā)揮重要作用。2.FUW-TetO-Dmrt1慢病毒載體配合rtTA輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染雄性生殖干細(xì)胞及永生化的mGSCs-I-SB細(xì)胞系,篩選出最適誘導(dǎo)DMRT1表達(dá)的Dox濃度。EDU、雙熒光素酶檢測(cè)、免疫熒光染色、Western blotting、及定量PCR進(jìn)一步揭示DMRT1對(duì)于山羊雄性生殖干細(xì)胞發(fā)育過(guò)程的功能。在1μg/mL Dox誘導(dǎo)條件下,雄性生殖干細(xì)胞增殖能力及分化水平顯著增高,減數(shù)分裂相關(guān)標(biāo)記相應(yīng)下調(diào)。維甲酸引起雄性生殖干細(xì)胞的減數(shù)分裂,但過(guò)表達(dá)DMRT1抑制減數(shù)分裂的發(fā)生同時(shí)mGSCs的增殖標(biāo)記PCNA及分化標(biāo)記c-KIT表達(dá)上調(diào)。因此DMRT1一方面促進(jìn)雄性生殖干細(xì)胞的增殖和分化,另一方面抑制由RA引起的減數(shù)分裂異常起始,從而維持精原細(xì)胞有絲分裂和減數(shù)分裂的平衡。3.DMRT1在睪丸生殖免疫中發(fā)揮重要功能,DMRT1通過(guò)抑制TLRs信號(hào)通路從而降低雄性生殖干細(xì)胞中炎癥反應(yīng)的發(fā)生。shRNA干擾睪丸雄性生殖干細(xì)胞中DMRT1的表達(dá),轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及免疫組化試驗(yàn)結(jié)果顯示mGSCs中TLR4及NF-κB被激活。ELISA及Western blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)雄性生殖干細(xì)胞內(nèi)促炎因子TNFα及IL-6的表達(dá)上調(diào)。免疫共沉淀及雙熒光素酶檢測(cè)試驗(yàn)進(jìn)一步揭示DMRT1招募PLZF蛋白,二者共同抑制TLR4和NF-κB的轉(zhuǎn)錄并促進(jìn)雄性生殖干細(xì)胞數(shù)量的回補(bǔ)。與此同時(shí),TUNEL染色及流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)DMRT1抑制由炎癥反應(yīng)引起的雄性生殖干細(xì)胞的凋亡。綜合以上結(jié)果表明DMRT1在促進(jìn)雄性生殖干細(xì)胞自我更新及維持睪丸內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中的重要功能,提供了治療睪丸生殖缺陷疾病的新思路。4.白消安處理的小鼠睪丸表現(xiàn)出嚴(yán)重的生殖細(xì)胞損傷,過(guò)表達(dá)DMRT1顯著恢復(fù)了雄性生殖干細(xì)胞的數(shù)量并且維持精子發(fā)生的正常進(jìn)行。免疫熒光染色及ELISA檢測(cè)的結(jié)果表明DMRT1促進(jìn)雄性生殖干細(xì)胞增殖標(biāo)記PCNA、VASA及自我更新相關(guān)標(biāo)記PLZF及CSF1R的表達(dá)。同時(shí)mGSCs自我更新相關(guān)的細(xì)胞因子GDNF、CSF1表達(dá)上調(diào),從而證明DMRT1對(duì)睪丸內(nèi)環(huán)境的重建至關(guān)重要�；陔p分子熒光互補(bǔ)技術(shù)(BiFC)和免疫共沉淀檢測(cè),最終確認(rèn)DMRT1蛋白與PLZF蛋白互作主要是由DMRT1與PLZF的BTB結(jié)構(gòu)域互作來(lái)實(shí)現(xiàn)的。所以DMRT1與PLZF發(fā)揮協(xié)同作用參與雄性生殖干細(xì)胞自我更新下游通路的調(diào)節(jié)。除此之外,DMRT1和PLZF作為抑炎因子有效地抑制曲細(xì)精管內(nèi)炎癥的發(fā)生,為雄性生殖細(xì)胞損傷的修復(fù)建立了良好的微環(huán)境。綜上所述,我們首次探究了DMRT1在雄性生殖干細(xì)胞中的表達(dá)模式,探索了DMRT1對(duì)山羊雄性生殖干細(xì)胞分化和自我更新過(guò)程的影響,并揭示DMRT1在生殖免疫中發(fā)揮的功能。基因修飾載體轉(zhuǎn)染山羊雄性生殖干細(xì)胞,體內(nèi)體外綜合分析、驗(yàn)證篩選DMRT1可能作用的特異靶基因及其互作機(jī)制,為研究山羊雄性生殖干細(xì)胞的自我更新、精子發(fā)生的機(jī)理提供新的科學(xué)依據(jù);為高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)家畜的遺傳、繁育和不育癥的防治提供新方案。
【圖文】：

圖 1-1 PGCs 向精子細(xì)胞分化示意圖 (Griswold et al. 2013)。 1-1 The pattern of PGCs differentiate into sperm cells (Griswold et al. 20殖干細(xì)胞微環(huán)境研究進(jìn)展生殖干細(xì)胞與微環(huán)境干細(xì)胞與其生存的周圍環(huán)境被稱為雄性生殖干細(xì)胞微環(huán)境1-2A)，這個(gè)微環(huán)境主要包括曲細(xì)精管基底膜、支持細(xì)胞、管管內(nèi)皮細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)以及細(xì)胞分子等 (Bhang et al. 20胞主要定位在曲細(xì)精管基底膜上，受多種基因的調(diào)控和內(nèi)因此這個(gè)微環(huán)境構(gòu)成了調(diào)控雄性生殖干細(xì)胞自我更新與分2018; Dadoune 2007)。

圖 1-1 PGCs 向精子細(xì)胞分化示意圖 (Griswold et al. 2013)。Fig 1-1 The pattern of PGCs differentiate into sperm cells (Griswold et al. 2013).1.2 雄性生殖干細(xì)胞微環(huán)境研究進(jìn)展1.2.1 雄性生殖干細(xì)胞與微環(huán)境雄性生殖干細(xì)胞與其生存的周圍環(huán)境被稱為雄性生殖干細(xì)胞微環(huán)境或雄性生殖胞龕 (圖 1-2A)，這個(gè)微環(huán)境主要包括曲細(xì)精管基底膜、支持細(xì)胞、管周肌樣細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)以及細(xì)胞分子等 (Bhang et al. 2018) (圖 1-2B性生殖干細(xì)胞主要定位在曲細(xì)精管基底膜上，，受多種基因的調(diào)控和內(nèi)分泌及旁分號(hào)的調(diào)節(jié)。因此這個(gè)微環(huán)境構(gòu)成了調(diào)控雄性生殖干細(xì)胞自我更新與分化的強(qiáng)大系Bhang et al. 2018; Dadoune 2007)。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S827

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 張濤;;基于組織自我更新策略的學(xué)校文化發(fā)展路徑[J];中國(guó)教師;2011年01期

2 徐秀英;龐紅威;柳麗榮;尚雅珍;李宏蓮;;試論學(xué)校升格后中專教師自我更新的基本路徑[J];隴東學(xué)院學(xué)報(bào);2015年03期

3 紫荊;;今天的你并非是昨天的你[J];風(fēng)流一代;2017年35期

4 王玉萍;;論教師自我更新的機(jī)制[J];科技信息(學(xué)術(shù)研究);2006年11期

5 肖志華;;把創(chuàng)新變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)[J];企業(yè)家天地;2006年02期

6 加里·哈美爾 ,何蔚;把創(chuàng)新變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)[J];通信企業(yè)管理;2004年05期

7 劉愛敏;21世紀(jì)圖書館文獻(xiàn)信息人員的自我更新勢(shì)在必行[J];引進(jìn)與咨詢;2004年11期

8 黃偉莉 ,余英 ,彭利軍;教師的自我更新[J];江西教育科研;2004年12期

9 白益民;教師的自我更新:背景、機(jī)制與建議[J];華東師范大學(xué)學(xué)報(bào)(教育科學(xué)版);2002年04期

10 魏磊;論企業(yè)的市場(chǎng)決勝法則──自我更新[J];經(jīng)濟(jì)體制改革;1998年04期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 李芳菲;王亞平;;胚胎干細(xì)胞自我更新的分子機(jī)制[A];中國(guó)解剖學(xué)會(huì)第八屆組織學(xué)與胚胎學(xué)專業(yè)青年研討會(huì)論文集[C];2004年

2 宋獻(xiàn)民;袁有忠;沈紅梅;俞■;徐鋒;Huang Paulina;Shields Donna;程濤;王健民;;HOXB4調(diào)控造血干細(xì)胞自我更新的機(jī)制研究[A];第10屆全國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)會(huì)議論文摘要匯編[C];2005年

3 張吉敏;;與茶結(jié)緣悟茶道——探少兒茶藝開展的意義[A];“大禹]罕比俁枰昭刑只狒呱俁枰昭肴募痆C];2006年

4 李南;張萌萌;;“自我更新”取向視角下的高校輔導(dǎo)員幸福觀研究[A];2011年全國(guó)高校學(xué)生工作年會(huì)論文集[C];2011年

5 龐全海;馬勇江;張慧茹;華進(jìn)聯(lián);楊學(xué)義;竇忠英;;造血干細(xì)胞研究現(xiàn)狀及應(yīng)用前景[A];全國(guó)首屆動(dòng)物生物技術(shù)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2004年

6 黃志雄;張雙玲;吳磊;陳丹;王萍;宋世震;江高峰;;低劑量鎘模擬雌激素樣作用誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜上皮干細(xì)胞自我更新和增殖[A];中國(guó)毒理學(xué)會(huì)第六屆全國(guó)毒理學(xué)大會(huì)論文摘要[C];2013年

7 黃鷺;;土家吊腳樓聚落自我更新研究——以恩施宣恩彭家寨為例[A];中國(guó)民族建筑研究會(huì)第二十屆學(xué)術(shù)年會(huì)論文特輯（2017）[C];2017年

8 朱妮;王華芳;王斌生;付珊;韋潔平;單威;黃河;;NR2F2參與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞自我更新和多能分化的干性維持[A];2015年浙江省血液病學(xué)學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2015年

9 王進(jìn)芬;;列寧關(guān)于黨內(nèi)民主功能的重要認(rèn)識(shí)[A];中國(guó)國(guó)際共運(yùn)史學(xué)會(huì)2012年年會(huì)暨學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2012年

10 劉起東;康九紅;;胚胎干細(xì)胞干性維持和DNA損傷修復(fù)的新發(fā)現(xiàn)[A];中國(guó)解剖學(xué)會(huì)2015年年會(huì)論文文摘匯編[C];2015年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 北京電影學(xué)院教授 杜慶春;“星戰(zhàn)”系列能否實(shí)現(xiàn)自我更新？[N];文匯報(bào);2018年

2 管璇悅;微創(chuàng)新，助教育自我更新[N];貴陽(yáng)日?qǐng)?bào);2018年

3 王琦琦;像蛇一樣自我更新[N];中國(guó)青年報(bào);2013年

4 余爽;在快速變化的社會(huì)中保持自我更新與成長(zhǎng)[N];黑龍江日?qǐng)?bào);2018年

5 牛津大學(xué)博士 尹伊文;透明合法的“腐敗”：體制自我更新的教訓(xùn)[N];南方周末;2012年

6 牛津大學(xué)博士 尹伊文;透明合法的“腐敗”：體制自我更新的教訓(xùn)[N];南方周末;2012年

7 本報(bào)記者 吳兢;鞍鋼：走自我更新之路[N];人民日?qǐng)?bào);2000年

8 華東師范大學(xué)基礎(chǔ)教育改革與發(fā)展研究所 李家成;在相通中實(shí)現(xiàn)教育自我更新[N];光明日?qǐng)?bào);2014年

9 鐘沛璋;堅(jiān)持自我更新是革命者的情懷[N];中國(guó)教育報(bào);2008年

10 力納;政府應(yīng)助中小出口加工企業(yè)完成自我更新[N];消費(fèi)日?qǐng)?bào);2008年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 魏于棟;DMRT1調(diào)控山羊雄性生殖干細(xì)胞分化、自我更新的機(jī)理[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2019年

2 于淼瑛;表皮生長(zhǎng)因子受體功能缺失對(duì)小鼠胚胎干細(xì)胞自我更新和多能性影響的研究[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2017年

3 宋獻(xiàn)民;細(xì)胞周期素依賴激酶抑制因子在造血干細(xì)胞自我更新調(diào)控中的作用[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2005年

4 趙明;人胚胎干細(xì)胞自我更新相關(guān)新基因的克隆及功能研究[D];中南大學(xué);2008年

5 金佳麗;USP21調(diào)控小鼠胚胎干細(xì)胞自我更新及重編程的功能及其機(jī)制的研究[D];華東師范大學(xué);2017年

6 魏青;小分子SC1維持小鼠干細(xì)胞自我更新分子機(jī)制的研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2017年

7 李雅木;轉(zhuǎn)錄因子PRRX1通過(guò)激活多巴胺受體基因DRD2的表達(dá)來(lái)維持膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的自我更新和成瘤性[D];武漢大學(xué);2015年

8 劉爍;FOXP3對(duì)結(jié)腸癌干細(xì)胞自我更新的影響及其機(jī)制研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2017年

9 傅子文;果蠅基因Twin在卵巢生殖干細(xì)胞系的維持和分化中的作用[D];清華大學(xué);2015年

10 劉陶迪;大鼠青春期前期精原干細(xì)胞自我更新和分化相關(guān)基因表達(dá)的初步研究[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2012年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 王小虎;Tfcp211誘導(dǎo)Esrrb表達(dá)促進(jìn)小鼠胚胎干細(xì)胞自我更新的機(jī)制研究[D];安徽大學(xué);2019年

2 孫紅偉;IWR1維持人胚胎干細(xì)胞自我更新的分子機(jī)制研究[D];安徽大學(xué);2019年

3 白紅霞;細(xì)胞外基質(zhì)剛度對(duì)腫瘤細(xì)胞自我更新的調(diào)控作用及機(jī)制研究[D];電子科技大學(xué);2018年

4 湯玲;Sp5維持小鼠胚胎干細(xì)胞自我更新的分子機(jī)制研究[D];安徽大學(xué);2018年

5 劉奎升;Tfcp2l1促進(jìn)小鼠胚胎干細(xì)胞自我更新的機(jī)制研究[D];安徽大學(xué);2018年

6 謝曉靜;論教師的教育習(xí)慣及其更新[D];曲阜師范大學(xué);2015年

7 林敏;bFGF激活PI3K信號(hào)通路調(diào)控大鼠胚胎干細(xì)胞自我更新[D];浙江理工大學(xué);2016年

8 呂林潔;人胚胎干細(xì)胞分化為可自我更新的神經(jīng)干細(xì)胞[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2016年

9 何貴成;CAS抑制MHCC97干樣細(xì)胞自我更新的研究[D];南華大學(xué);2014年

10 武思宇;深度測(cè)序法篩選和鑒定維持奶山羊雄性生殖干細(xì)胞自我更新的關(guān)鍵因子[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2016年

本文編號(hào)：2616813