【摘要】：豬病毒性傳染病的頻繁發(fā)生嚴(yán)重制約著我國養(yǎng)豬業(yè)快速、健康發(fā)展。當(dāng)前,我國面臨著舊病未除、新病又發(fā)的局面。因此病毒溯源在豬病毒性傳染病的防控中起著舉足輕重的作用。以往開展的豬病毒性傳染病流行病學(xué)調(diào)查多依賴傳統(tǒng)的技術(shù)方法,存在著檢測病原單一、獲得數(shù)據(jù)有限的問題。隨著新技術(shù)的不斷出現(xiàn),病毒宏基因組學(xué)(Viral Metagenomics)為大規(guī)模檢測和發(fā)現(xiàn)宿主體內(nèi)存在的已知或未知的病毒提供了強(qiáng)有力的工具,目前已廣泛應(yīng)用于病毒性傳染病流行病學(xué)調(diào)查研究中。我國曾于20世紀(jì)90年代開展過全國性大規(guī)模的豬病毒性傳染病流行病學(xué)調(diào)查,采集了大量臨床發(fā)病豬的組織樣品,但受限于當(dāng)時分子生物學(xué)檢測技術(shù)的制約,所采集的臨床發(fā)病豬攜帶病毒的本底情況并未充分得知,對于當(dāng)前新發(fā)現(xiàn)的病毒,是否在當(dāng)時就已經(jīng)存在,對于長期流行的病毒,現(xiàn)流行毒株與二十年前流行毒株是否存在差異,其遺傳進(jìn)化規(guī)律如何,這些數(shù)據(jù)我們知之甚少,亟需開展相關(guān)研究。本研究對1990-1999年的100份臨床發(fā)病豬的組織樣品進(jìn)行了病毒宏基因組學(xué)分析,結(jié)果顯示共有16646條reads注釋到了病毒序列,分屬于14個病毒科和未分類病毒,其中4個病毒科為噬菌體,其余11個科為哺乳動物病毒科,主要包括圓環(huán)病毒科(Circoviridae)、細(xì)小病毒科(Parvoviridae)、黃病毒科(Flaviviridae)、小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)、指環(huán)病毒科(Anelloviridae)、逆轉(zhuǎn)錄病毒科(Retroviridae)和動脈炎病毒科(Arteriviridae)等。其中圓環(huán)病毒科中病毒reads數(shù)量最多,細(xì)小病毒科中病毒reads種類最為豐富。豬圓環(huán)病毒3型(porcine circovirus type 3,PCV3)是一種與豬皮炎腎病綜合征、繁殖功能障礙、呼吸系統(tǒng)疾病和多系統(tǒng)炎癥有關(guān)的病毒,首次于2015年在美國被發(fā)現(xiàn),隨后多個國家報道存在該病毒感染,我國PCV3感染的報道最早見于2015年,然而該病毒在此之前的感染與流行情況并不清楚。本研究對我國29個省、市、自治區(qū)的307份(1990-1999年:200份;2011-2017年:107份)臨床組織樣品進(jìn)行了PCV3的特異性PCR檢測,檢測結(jié)果顯示:陽性率為7.8%(24/307),陽性樣品分布在8個省和1個自治區(qū),最早出現(xiàn)在1996年。核苷酸序列比對分析結(jié)果顯示,本研究獲得的PCV3毒株與我國和國際現(xiàn)有的參考毒株在ORF2和全基因組水平上核苷酸同源性分別為96.6% 99.7%和97.1% 99.4%,該結(jié)果表明PCV3在過去20年中具有較高的遺傳穩(wěn)定性。豬細(xì)小病毒(porcine parvoviruses,PPV)是細(xì)小病毒科中能夠引起豬繁殖功能障礙、消化和呼吸系統(tǒng)疾病的病毒的統(tǒng)稱,包括經(jīng)典的豬細(xì)小病毒1型(PPV1),以及近幾年國內(nèi)外陸續(xù)發(fā)現(xiàn)的豬細(xì)小病毒2-7型(PPV2-7)等新型細(xì)小病毒。結(jié)合宏基因組結(jié)果,本研究對我國30個省、市、自治區(qū)的437份(1990-1999:200份;2011-2017:237份)臨床組織樣品進(jìn)行了PPV1-7的特異性PCR檢測,檢測結(jié)果顯示:58.1%(254/437)的樣品至少存在1種細(xì)小病毒感染,樣品檢測陽性率從高到低依次為PPV6(31.1%)、PPV2(28.4%)、PPV3(22.2%)、PPV7(13.5%)、PPV4(11.4%)、PPV5(5.9%)和PPV1(5.0%),PPV1-7陽性樣品最早出現(xiàn)的年份分別為1998、1990、1993、1994、1999、1993和1997年。遺傳進(jìn)化分析結(jié)果顯示:PPV2的ORF2基因核苷酸同源性為93.7%-100%,與我國和國際現(xiàn)有的參考毒株核苷酸同源性為92.8%-99.2%,可劃分為2a-2h共8個基因型,1990-1999年我國流行的毒株主要為2a,2011年以后2a-2d和2g-2h都有流行,重組分析表明,26個重組毒株中有21個屬于2c-2e,分別以2b、2g和2h毒株為重組親本;獲得的PPV3毒株與現(xiàn)有的參考毒株在ORF1和ORF2基因水平上核苷酸同源性分別為95.5%-99.5%、96.1%-99.4%;PPV4與現(xiàn)有的參考毒株在ORF1、ORF2和ORF3基因水平核苷酸同源性分別為96.2%-99.9%、98.4%-99.8%、96.0%-100%;PPV5毒株在ORF1和ORF2基因水平上核苷酸同源性分別為97.4%-99.9%、98.8%-99.8%,這表明PPV3-5在過去的20年具有較高的遺傳穩(wěn)定性;獲得的PPV6毒株與現(xiàn)有的參考毒株在ORF1和ORF2基因核苷酸同源性分別為98.4%-99.8%、94.8%-99.8%,可分為2個基因型,分別為6a、6b,1990-1999年我國主要流行6b,2014年后兩個基因型都有流行;獲得的PPV7毒株與現(xiàn)有的參考毒株在ORF1和ORF2基因水平上核苷酸同源性分別為92.9%-99.2%、84.0%-98.9%,可劃分為7a-7f共6個基因型,1990-1999年我國流行的毒株主要以7a為主,其次是7d和7e,2011年以后,6個亞型在我國均有流行,其中廣東和廣西主要以7b為主,且7b基因型的毒株為廣東和廣西所特有,7f只有一個毒株,來自于我國廣西,此外,PPV7存在基因缺失和基因重組現(xiàn)象。本研究采用病毒宏基因組方法對我國20世紀(jì)90年代發(fā)病豬群攜帶病毒的情況進(jìn)行了摸底研究,并對其攜帶的PCV3、PPV1-7進(jìn)行了分子流行病學(xué)調(diào)查,其研究發(fā)現(xiàn)極大的豐富了我國PCV3和PPV1-7感染的流行病學(xué)數(shù)據(jù),為該病的監(jiān)測預(yù)警、診斷與預(yù)防奠定了科學(xué)基礎(chǔ)。
【圖文】：

東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)碩士學(xué)位論文2 材料與方法2.1 實驗材料2.1.1 臨床樣品本研究所用的 437 份臨床發(fā)病豬的組織樣品由實驗室收集并保存，樣品類型包括脾臟、腎臟、淋巴結(jié)和肺臟等，每一份樣品都來自于不同的豬場，分別于 1990-1999 年和 2011-2017年采集自我國 21 個省、5 個自治區(qū)和 4 個直轄市，樣品詳細(xì)信息見圖 2-1 和表 2-1。從地理分布看，廣東省的樣品數(shù)量最多，其次是黑龍江、湖南和廣西，而寧夏、四川、浙江和重慶僅有 1 份。從時間分布看，樣品主要采集自 1999、2017 和 1998 年，其次是 2015、2011、2014、1996 年，而 1990、1994 和 2004 年僅有 1 份。樣品在使用前后均保存于-80℃冰箱。

3 結(jié)果3.1 宏基因組測序結(jié)果100 份組織樣品的宏基因組測序結(jié)果顯示，共有 16646 條 reads 注釋到了病毒序列，分屬于 14 個病毒科和未分類病毒，其中 4 個病毒科為噬菌體：長尾噬菌體（Siphoviridae）、短尾噬菌體（Podoviridae）、肌尾噬菌體（Myoviridae）和微病毒科（Microviridae），其余均為哺乳動物病毒。如圖 3-2 所示，，注釋到 reads 數(shù)量最多的是圓環(huán)病毒科，共有 13651 條，占總 reads數(shù)量的 82.0%，其次是黃病毒科，其 reads 數(shù)目為 1287 條，占 reads 數(shù)量的 7.7%。在哺乳動物病毒中，圓環(huán)病毒科的病毒主要為圓環(huán)病毒屬的 PCV2，reads 數(shù)量為 9879 條；細(xì)小病毒科的 reads 中有 161 條 reads 為博卡病毒，81 條 reads 為 PPV1，9 條 reads 為 PPV2，20 條 reads為 PPV6，16 條 reads 為 PPV7。黃病毒科的病毒主要為瘟病毒屬的豬瘟病毒；小核糖核酸病毒科中的病毒主要為腸道病毒和薩佩羅病毒；皰疹病毒科（Herpesviridae）的病毒為豬巨細(xì)胞病毒；逆轉(zhuǎn)錄病毒科（Retroviridae）的病毒為豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒；動脈炎病毒科（Arteriviridae）的病毒為豬藍(lán)耳病病毒；冠狀病毒科（Coronaviridae）中病毒為豬呼腸孤病毒；指環(huán)病毒科的病毒為 Torque teno sus virus。
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S858.28

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本文編號：2616711