發(fā)布時間：2020-04-05 01:08

【摘要】：H7N9亞型禽流感病毒(Avianinfluenzavirus,AIV)是一種新出現(xiàn)的人獸共患病原,自從20]3年首次在我國報道以來,在人類已引起5波流行,截止2017年]0月26日,共有1567人發(fā)病,其中包括615例死亡病例,病死率接近40%。早期的H7N9亞型AIV對家禽是低致病性的,家禽感染后無明顯癥狀。2017年初開始出現(xiàn)對家禽呈高致病性的H7N9亞型AIV,分布于全國17個省份,并引發(fā)多起疫情。2017年下半年,重組AIV(H5+H7)二價滅活疫苗使用后,有效控制了家禽中的H7N9疫情,也顯著減少了人的感染病例。但目前仍可在我國個別省份分離到對雞和鴨均呈高致病性的H7N9和H7N2亞型AIV,使我國H7亞型AIV的防控面臨新的挑戰(zhàn)。因此迫切需要研制可用于區(qū)別自然感染和疫苗免疫動物的標(biāo)記疫苗以及快速檢測方法用于H7亞型AIV的防控和凈化。1.鑒別九種禽流感病毒神經(jīng)氨酸酶基因的—步法多重探針組合rRT-PCR方法的建立目前,已經(jīng)在家禽和野鳥中鑒定出了 9種不同的禽流感病毒神經(jīng)氨酸酶(NA)亞型,由于AIV很容易發(fā)生重組,同一種血凝素(HA)亞型的AIV可能存在不同的NA組合,在鑒定HA的同時也需要鑒定出NA亞型。我們設(shè)計了 9個亞型的NA引物-探針對,根據(jù)探針的不同熒光染料(FAM,HEX和TexasRed)將其分成3組,開發(fā)了一種基于多重探針組合的一步法rRT-PCR。結(jié)果顯示,該多重rRT-PCR方法中的每組引物·探針對檢測相應(yīng)的不同亞型的NA特異性良好,無交叉反應(yīng);其檢測限均小于100copies和100EID50。利用該方法分別檢測人工感染H9N2病毒雞的排毒樣品和活禽交易市場的臨床樣品,結(jié)果顯示,該方法檢測結(jié)果的陽性率與病毒分離和基因測序方法的結(jié)果相一致,且靈敏度更高。綜上所述,我們建立的這種快速、特異且靈敏的多重探針組合rRT-PCR方法,為NA分型提供了新的快速檢測方法。2.快速檢測H7亞型禽流感病毒的免疫膠體金試紙條的研制以H7N9亞型AIV(A/Chicken/Jiangsu/W1-8/2015,W1-8)作為免疫原制備單克隆抗體,利用抗原逃逸試驗和HA基因序列測定及分析確定其針對的抗原表位,選擇具有不同抗原表位的單抗研制檢測H7亞型AIV的免疫膠體金試紙條。結(jié)果顯示,共獲得了13株具有血凝抑制特性的單抗,鑒定出198、227和235位3個抗原表位。選取了針對227位和235位的單抗制備免疫膠體金試紙條,結(jié)果表明,該試紙條具有良好的特異性、穩(wěn)定性。棉拭和組織樣品的檢測限均為2.5 1og10 EID50/0.1mL�；钋菔袌鰳悠返牟《緳z出率為3%(6/200),與病毒分離結(jié)果(4.5%,9/200)和HA基因PCR測序結(jié)果(3.5%,7/200)一致。這為現(xiàn)場快速檢測H7亞型AIV提供了新方法。3.H7N9亞型禽流感病毒滅活標(biāo)記疫苗的研制通過多肽芯片的檢測方法成功篩選到針對H7N9亞型AIV HA2上的特異性抗原表位H7-12肽,利用反向遺傳技術(shù)修飾該抗原表位,并以H7N9毒株A/Chicken/Huadong/JD/17(JD/17)為骨架,研制出H7N9亞型AIV滅活標(biāo)記疫苗候選株A/Chicken/Huadong/JD-cHA/17(JD-cHA/17)。該疫苗候選株的 HA 效價為 10 Log2,EID50 為 9.67 Log10oEID50/mL;在一次免疫雞群3周后,HI抗體效價能達(dá)到9.2±0.6,表明該疫苗候選株具有良好的抗原性和免疫原性。攻毒保護試驗結(jié)果表明,該疫苗候選株的免疫保護效果與母本毒株相當(dāng),對高致病性(HP)和低致病性(LP)H7N9AIVs均有100%的保護率。利用H7-12多肽芯片技術(shù)成功檢測出自然感染后第3d血清轉(zhuǎn)陽情況[信噪比(SNR)=2.33±0.15],靈敏度高于HI試驗(HI=0)。疫苗候選株DIVA特性驗證結(jié)果顯示,利用H7-12多肽芯片檢測疫苗候選株JD-cHA/17免疫血清(HI=9.2±0.6)和野生型毒株JD/17免疫血清(HI=9.1±0.5),其針對H7-12多肽的SNR值分別為0.44±0.14和6.39±0.13,差異極顯著,表明該滅活標(biāo)記疫苗不能誘導(dǎo)針對H7特異性的H7-12多肽的抗體,具有DIVA特性和廣泛的應(yīng)用前景。4.區(qū)分H7N9亞型禽流感標(biāo)記疫苗免疫血清和野毒株感染血清的競爭抑制ELISA方法的建立利用H7特異性表位H7-12多肽與BSA偶聯(lián)作為免疫原,成功制備了 6株單克隆抗體。IFA和Western-blot試驗結(jié)果顯示,該6株單抗均能與H7N9亞型AIVJD/17反應(yīng),特異性良好。以JD/17自然感染血清和JD-cHA/17免疫血清為測試血清樣品,利用競爭抑制ELISA方法,成功篩選出具有高抑制率的單抗3G10。將H7-12多肽作為包被抗原,純化的3G10單抗腹水以辣根過氧化酶(HRP)進(jìn)行標(biāo)記作為檢測抗體,建立針對H7-12抗體的競爭抑制ELISA方法。對競爭抑制ELISA方法的反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化,確定抗原的最適包被濃度為50μ噸/mL,酶標(biāo)抗體的最適工作濃度為1:200,待檢血清最適稀釋度為1:4,封閉液的最佳選擇為8%的小牛血清封閉90 min,TMB的最佳反應(yīng)時間為10min。判斷標(biāo)準(zhǔn)為抑制率≥20%為陽性,≤16%為陰性。運用本方法檢測JD/17自然感染血清為陽性,檢測JD-cHA/17 免疫血清,HI、H3、H4、H5(RE-6、RE-7 和 RE-8)、H6、H9 和 H10 亞型 AIV的陽性血清均為陰性,說明該競爭抑制ELISA方法具有良好的特異性,可有效區(qū)分JD/17自然感染血清和JD-cHA/17免疫血清。
【圖文】：

＿２０１７０２／ｅｎ／）。從人類首次報道邋Ｈ７Ｎ９逡逑病毒感染以來，己經(jīng)發(fā)生了邋５次流行（圖１）。自２０１３－１４年感染病例達(dá)到高峰后，后幾次逡逑的流行感染人數(shù)普遍較低，直至第５次流行的出現(xiàn)，感染人數(shù)又出現(xiàn)了一個新的高峰，超逡逑過之前任何一次流行。值得注意的是，Ｈ７Ｎ９病毒感染人事件有從東部逐漸向西部蔓延的逡逑趨勢，其中在第五次流行中，該病毒在中國西部的一些省份（重慶、甘肅、四川和西藏）逡逑首次被發(fā)現(xiàn)（圖１－Ａ）。這表明，隨著疫情的發(fā)展，未來Ｈ７Ｎ９亞型ＡＩ＼＾的防控不僅包括華逡逑南地區(qū)，還需要關(guān)注西部的省份（ｗｗｗ．ｃｈｐ．ｇｏｖ．ｈｋ／ｆｉｌｅｓ／ｐｄｆ／２０１７＿ａｖｉａｎ＿ｉｎｆｌｕｅｎｚａ＿ｒｅｐｏｒｔ＿逡逑ｖｏｌｌ３＿ｗｋｌ７＿ｃｈｉ．ｐｄｆ）。在感染病例中，男性的比例（６９％）要高于女性的比例位迎（圖１－Ｂ）。逡逑據(jù)統(tǒng)計，大多數(shù)的感染病例包括４０－６０歲及以上的個體。而最近的一項研究表明，在第Ｓ逡逑次流行中

胞核進(jìn)行病毒復(fù)制覽兇。根據(jù)ＮＡ蛋白抗原性的不同，可將目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的Ａ型流感病毒逡逑分為１１種不同的ＮＡ亞型，，其中Ｎ１－Ｎ９亞型源于ＡＩＶ的自然宿主野生水禽，而Ｎ１０和逡逑Ｎｉｌ亞型則從蝙蝠中分離到１６３邋（圖２－Ｂ）。目前，ＮＫ邋Ｍ２、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ８、Ｎ９和Ｎ１０等亞逡逑型流感病毒的ＭＡ蛋白晶體結(jié)構(gòu)己經(jīng)解析出來，它們在結(jié)構(gòu)上大體相同（圖３）。逡逑ＮＡ蛋白在結(jié)構(gòu)上形成一個四聚體
【學(xué)位授予單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S852.65

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2614318