【摘要】：禽致病性大腸桿菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)是引起禽大腸桿菌病的主要病原,該病臨床主要表現(xiàn)為大腸桿菌性敗血癥、心包炎、肝周炎、氣囊炎等,給世界養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。APEC的毒力因子眾多,其中,外膜蛋白是在宿主-病原體界面發(fā)揮核心作用的關(guān)鍵毒力因子。外膜蛋白T(Outermembraneprotein T,OmpT)是存在于大腸桿菌外膜的一種蛋白水解酶,屬于Omptin外膜蛋白酶家族,可能在細(xì)菌感染宿主的粘附過(guò)程中發(fā)揮作用。大腸桿菌K12菌株染色體編碼的OmpT是Omptin家族中第一個(gè)被解析結(jié)構(gòu)的蛋白,該OmpT由10條反向平行的β折疊構(gòu)成中空的桶狀結(jié)構(gòu),從細(xì)菌外膜的脂質(zhì)雙分子層伸向細(xì)胞外。本實(shí)驗(yàn)室在研究中發(fā)現(xiàn),APEC E058株(02血清型)既有染色體基因(compT)編碼的 OmpT(cOmpT),也有 ColV 質(zhì)粒基因(pompT)編碼的 OmpT(pOmpT),cOmpT與pOmpT的氨基酸同源性高達(dá)73.6%。目前關(guān)于染色體編碼的cOmpT研究相對(duì)充分,但質(zhì)粒編碼的pOmpT研究很少。本實(shí)驗(yàn)室的前期研究結(jié)果表明,cOmpT能夠水解魚精蛋白;pOmpT在APEC的致病中具有重要作用,卻不具有cOmpT水解魚精蛋白的能力。因此,我們有必要對(duì)pOmpT進(jìn)行晶體學(xué)研究,以期從結(jié)構(gòu)角度解析pOmpT和cOmpT功能差異的原因。在本研究中,我們構(gòu)建了不含信號(hào)肽的pOmpT重組蛋白表達(dá)菌株BL21(DE3)pET30a-pompT并對(duì)該菌株進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),獲得了包涵體形式的pOmpT蛋白,體外變性和復(fù)性結(jié)果表明,獲得的pOmpT目的蛋白在凝膠過(guò)濾層析后出現(xiàn)自水解,不利于后續(xù)結(jié)晶試驗(yàn)。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道,cOmpT蛋白進(jìn)行K217G點(diǎn)突變后可以避免自水解,在此基礎(chǔ)上,我們構(gòu)建了 BL21(DE3)pET30a-popmT(K217G)和 BL21(DE3)pET30a-pompT(K217G)-His表達(dá)菌株,誘導(dǎo)表達(dá)獲得了 pOmpT(K217G)和pOmpT(K217G)-His蛋白,發(fā)現(xiàn)二者同樣可以有效避免自水解。帶有His標(biāo)簽的蛋白可以在鎳柱純化的同時(shí)進(jìn)行結(jié)晶去污劑交換,配合后續(xù)的凝膠過(guò)濾層析進(jìn)一步純化,為結(jié)晶實(shí)驗(yàn)作準(zhǔn)備。我們對(duì)獲得的高純度蛋白進(jìn)行了結(jié)晶條件初篩。對(duì)pOmpT(K217G)蛋白所生長(zhǎng)的晶體進(jìn)行衍射,均為假陽(yáng)性鹽晶,而pOmpT(K217G)-His基本均為蛋白晶體,故后續(xù)試驗(yàn)均以pOmpT(K217G)-His進(jìn)行優(yōu)化篩選。在對(duì)結(jié)晶條件MemMeso-17進(jìn)行優(yōu)化后,獲得了衍射度約為7A的晶體,且該條件下的晶體生長(zhǎng)穩(wěn)定。我們對(duì)pOmpT蛋白穩(wěn)定結(jié)晶條件的大量摸索,為最終獲得pOmpT晶體結(jié)構(gòu)并闡明pOmpT的生物學(xué)功能積累了寶貴數(shù)據(jù)。另外,我們還構(gòu)建了含有cOmpT信號(hào)肽的BL21(DE3)pET30a-compT-His、BL21(DE3)pET30a-compT(K237G)-His 表達(dá)菌和含有 pOmpT 信號(hào)肽的 BL21(DE3)pET30a-pompT-His、BL21(DE3)pET30a-popT(K237G)-His 表達(dá)菌株,以野生株 E058 和空載體菌 BL21(DE3)pET30a為對(duì)照,測(cè)定了六個(gè)菌株對(duì)魚精蛋白的水解能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn),未經(jīng)突變的cOmpT能水解魚精蛋白,而經(jīng)K237G點(diǎn)突變(即不含有信號(hào)肽的K217G位點(diǎn)突變)的cOmpT不能水解魚精蛋白,pOmpT無(wú)論是否突變,都不能水解魚精蛋白。結(jié)果表明,K237氨基酸位點(diǎn)不僅在cOmpT和pOmpT蛋白穩(wěn)定中發(fā)揮關(guān)鍵作用,且在cOmpT水解魚精蛋白的酶活性中同樣十分重要。
【圖文】：

在接近ＯｍｐＴ的頂部，ｐ折疊形成了一個(gè)直徑約為３２邋Ａ的圓。而在中間部分，橫截面逡逑呈約１３Ａｘ邋２６邋Ａ的橢圓，以上數(shù)據(jù)皆是根據(jù)ａ位Ｃ原子的位置進(jìn)行判定的在膜區(qū)域內(nèi)，，逡逑桶是高度規(guī)則的、中空的、其內(nèi)帶正電荷（見圖１－３Ａ）邋［３１］。膜上方的桶狀結(jié)構(gòu)收縮扭曲，逡逑７邋個(gè)側(cè)鏈（Ｓｅｒ２２，Ｔｈｒ７３，Ａｒｇ７７，邋Ｇｌｎ２２８，Ａｓｎ２５８，邋Ｌｙｓ２５９邋和邋Ｌｙｓ２６０），從氫鍵到ｐ折疊逡逑中的主鏈原子，這個(gè)收縮區(qū)域呈多層，主要由保守的芳香族殘基組成，形成了一個(gè)大的、逡逑帶負(fù)電荷的溝底，其中包含蛋白水解活性位點(diǎn)，與ＯｍｐＴ能夠識(shí)別兩個(gè)連續(xù)的堿性氨基酸逡逑這一特性一致（見圖３Ａ）邋［３２】。這個(gè)溝部含有共１８?jìng)�(gè)氨基酸殘基，全部是0ｍｐｔｉｎ外膜蛋逡逑白酶家族的保守序列［３１】。ＬＰＳ對(duì)ＯｍｐＴ蛋白酶功能的激活具有重要作用【３ｉ，３３］。0ｍｐＴ膜外逡逑部分最外層的環(huán)，位于ＬＰＳ結(jié)合位點(diǎn)核心區(qū)域邊緣的正上方，將0ｍｐＴ分子沿著筒軸旋轉(zhuǎn)逡逑９０°

邐Ｔ３邐１７逡逑圖１－２．邋ＯｍｐＴ捅狀結(jié)構(gòu)拓?fù)淠Ｐ停校椤垮义希疲椋纾酰颍邋澹保玻澹希恚穑藻澹猓幔颍颍澹戾澹螅簦颍酰悖簦酰颍邋澹簦铮穑铮欤铮纾澹恚铮洌澹欤妫常保叔义献ⅲ喊被釟埢詥巫帜感问浇o出。正方形表示ｐ－鏈中的氨基酸殘基。側(cè)鏈指向ｐ桶外側(cè)的氨基酸標(biāo)記逡逑為灰色。位于細(xì)胞外的環(huán)標(biāo)記為Ｌ１－Ｌ５，周質(zhì)轉(zhuǎn)角標(biāo)記為Ｔ１－Ｔ４。每２５個(gè)殘基編號(hào)一次�；疑珔^(qū)域表逡逑示外膜的大概位置。逡逑Ｎｏｔｅ：邋Ａｍｉｎｏ邋ａｃｉｄ邋ｒｅｓｉｄｕｅｓ邋ａｒｅ邋ｇｉｖｅｎ邋ｉｎ邋ｓｉｎｇｌｅ邋ｌｅｔｔｅｒｓ．邋Ｓｑｕａｒｅｓ邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ邋ａｍｉｎｏ邋ａｃｉｄ邋ｒｅｓｉｄｕｅｓ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｐ－ｓｔｒａｎｄ．逡逑Ｔｈｅ邋ａｍｉｎｏ邋ａｃｉｄ邋ｗｉｔｈ邋ｔｈｅ邋ｓｉｄｅ邋ｃｈａｉｎ邋ｐｏｉｎｔｉｎｇ邋ｔｏ邋ｔｈｅ邋ｏｕｔｓｉｄｅ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｂｅｔａ邋ｂａｒｒｅｌ邋ｉｓ邋ｇｒａｙｅｄ邋ｏｕｔ．邋Ｔｈｅ邋ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ逡逑ｒｉｎｇ邋ｉｓ邋ｌａｂｅｌｅｄ邋ＬＩ－Ｌ５邋ａｎｄ邋ｔｈｅ邋ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ邋ｃｏｒｎｅｒ邋ｉｓ邋ｌａｂｅｌｅｄ邋Ｔ１－Ｔ４．邋Ｎｕｍｂｅｒｅｄ邋ｅｖｅｒｙ邋２５邋ｒｅｓｉｄｕｅｓ．邋Ｔｈｅ邋ｇｒａｙ邋ａｒｅａ逡逑ｉｎｄｉｃａｔｅｓ邋ｔｈｅ邋ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅ邋ｌｏｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｏｕｔｅｒ邋ｍｅｍｂｒａｎｅ．逡逑在接近ＯｍｐＴ的頂部，ｐ折疊形成了一個(gè)直徑約為３２邋Ａ的圓。而在中間部分，橫截面逡逑呈約１３Ａｘ邋２６邋Ａ的橢圓，以上數(shù)據(jù)皆是根據(jù)ａ位Ｃ原子的位置進(jìn)行判定的在膜區(qū)域內(nèi)，逡逑桶是高度規(guī)則的、中空的、其內(nèi)帶正電荷（見圖１－３Ａ）邋［３１］。膜上方的桶狀結(jié)構(gòu)收縮扭曲
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S852.61

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本文編號(hào)：2614535