【摘要】：一直以來,家畜胃腸道線蟲病的流行十分普遍,其中尤以捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病為甚,嚴(yán)重影響著畜牧業(yè)的健康發(fā)展。針對(duì)這一情況,人們陸續(xù)開發(fā)了系列高效、廣譜和低毒的驅(qū)蟲藥,但因抗藥性問題的產(chǎn)生,使得可用藥物的種類越來越少。有效解決這一問題的關(guān)鍵就是及時(shí)對(duì)耐藥性問題做出診斷和明確耐藥性的產(chǎn)生機(jī)制,但限于研究方法,目前仍沒有較為系統(tǒng)的耐藥性現(xiàn)狀和耐藥機(jī)理方面的信息。鑒于此,本研究以耐伊維菌素捻轉(zhuǎn)血矛線蟲為研究對(duì)象,對(duì)不同階段與不同蟲株的分泌產(chǎn)物進(jìn)行Shotgun LC-MS/MS分析,以為揭示捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的侵染機(jī)理、免疫逃避等的研究提供基礎(chǔ)信息,并可為疫苗抗原、藥物靶點(diǎn)或診斷標(biāo)記的篩選提供新的思路,對(duì)今后捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的防治研究具有重要意義。具體研究成果如下:(1)研究確定糖鹽水漂浮法為捻轉(zhuǎn)血矛線蟲蟲卵的最佳分離方法,并通過對(duì)8種備選培養(yǎng)基的篩選,確定M199培養(yǎng)基為捻轉(zhuǎn)血矛線蟲體外培養(yǎng)的最適培養(yǎng)基。(2)通過對(duì)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲培養(yǎng)條件的優(yōu)化和相應(yīng)指標(biāo)的測(cè)定發(fā)現(xiàn),在蟲體接種密度為30條時(shí),標(biāo)準(zhǔn)耐藥株和敏感株成蟲最佳培養(yǎng)條件為M199培養(yǎng)基700μL、青鏈霉素混合液(100×)300μL、兩性霉素B(2.5 mg/mL)20μL、伊維菌素(1 mg/mL)10 μL(僅耐藥株加入),分泌性蛋白質(zhì)最佳產(chǎn)生時(shí)間為75 h；其第三期脫鞘后幼蟲培養(yǎng)體系與成蟲一致,分泌性蛋白質(zhì)收集時(shí)間為10 d。(3)采用Shotgun LC-MS/MS技術(shù)對(duì)第三期脫鞘后幼蟲和成蟲分泌物進(jìn)行分析,結(jié)果在Uniprot蛋白數(shù)據(jù)庫中共鑒定到分泌性蛋白質(zhì)161個(gè),發(fā)現(xiàn)耐藥株特有蛋白質(zhì)為24個(gè),其中P糖蛋白13、β微管蛋白和乙酰膽堿門控氯離子通道ACC-2與蟲體耐藥性相關(guān),敏感株特有蛋白質(zhì)為62個(gè),敏感成蟲與耐藥成蟲共有蛋白質(zhì)為57個(gè);功能分析表明,這些蛋白質(zhì)主要參與蛋白質(zhì)水解、代謝、轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)折疊、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、離子輸運(yùn)、電子轉(zhuǎn)運(yùn)與分子結(jié)合等過程。(4)對(duì)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲分泌性蛋白質(zhì)的Western-blot檢驗(yàn)顯示,分泌性蛋白質(zhì)大小在15 kDa～200 kDa不等,且不同蟲株和同株不同階段蟲體的分泌性蛋白質(zhì)之間確實(shí)存在差異,其中敏感蟲株的條帶較耐藥株多,成蟲較幼蟲多。
【圖文】：

注：表示差異顯著（ＰＣ０．０５）。逡逑進(jìn)一步通過顯微鏡觀察三種方法所得蟲卵懸液中雜質(zhì)的情況，發(fā)現(xiàn)糖鹽水漂浮逡逑法所收集到的蟲卵回收率較高且所含雜質(zhì)較少（見圖１），鹽水離心法收集的蟲卵逡逑懸液雜質(zhì)較多，影響顯微鏡下對(duì)蟲卵的觀察（見圖２）；鹽水漂浮與糖鹽水漂浮結(jié)逡逑合法所得的蟲卵懸液較為干凈且雜質(zhì)很少，但其中蟲卵數(shù)量也較少（見圖３）。逡逑榦ｊ逡逑圖１糖鹽水漂浮法所獲蟲卵邐圖２鹽水離心法所獲蟲卵逡逑Ｆｉｇ．邋１邋Ｔｈｅ邋ｅｇｇｓ邋ｉｓｏｌａｔｅｄ邋ｂｙ邋ｔｈｅ邋ｆｌｏａｔｉｎｇ邋ｍｅｔｈｏｄ邋ｗｉｔｈ邋ｓｕｇａｒ邋ｂｒｉｎｅ邐Ｆｉｇ．２邋Ｔｈｅ邋ｅｇｇｓ邋ｉｓｏｌａｔｅｄ邋ｂｙ邋ｔｈｅ邋ｂｒｉｎｅ邋ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ邋ｍｅｔｈｏｄ逡逑

法所收集到的蟲卵回收率較高且所含雜質(zhì)較少（見圖１），鹽水離心法收集的蟲卵逡逑懸液雜質(zhì)較多，影響顯微鏡下對(duì)蟲卵的觀察（見圖２）；鹽水漂浮與糖鹽水漂浮結(jié)逡逑合法所得的蟲卵懸液較為干凈且雜質(zhì)很少，但其中蟲卵數(shù)量也較少（見圖３）。逡逑榦ｊ逡逑圖１糖鹽水漂浮法所獲蟲卵邐圖２鹽水離心法所獲蟲卵逡逑Ｆｉｇ．邋１邋Ｔｈｅ邋ｅｇｇｓ邋ｉｓｏｌａｔｅｄ邋ｂｙ邋ｔｈｅ邋ｆｌｏａｔｉｎｇ邋ｍｅｔｈｏｄ邋ｗｉｔｈ邋ｓｕｇａｒ邋ｂｒｉｎｅ邐Ｆｉｇ．２邋Ｔｈｅ邋ｅｇｇｓ邋ｉｓｏｌａｔｅｄ邋ｂｙ邋ｔｈｅ邋ｂｒｉｎｅ邋ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ邋ｍｅｔｈｏｄ逡逑
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S852.7

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2614228