【摘要】：一直以來,家畜胃腸道線蟲病的流行十分普遍,其中尤以捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病為甚,嚴重影響著畜牧業(yè)的健康發(fā)展。針對這一情況,人們陸續(xù)開發(fā)了系列高效、廣譜和低毒的驅(qū)蟲藥,但因抗藥性問題的產(chǎn)生,使得可用藥物的種類越來越少。有效解決這一問題的關(guān)鍵就是及時對耐藥性問題做出診斷和明確耐藥性的產(chǎn)生機制,但限于研究方法,目前仍沒有較為系統(tǒng)的耐藥性現(xiàn)狀和耐藥機理方面的信息。鑒于此,本研究以耐伊維菌素捻轉(zhuǎn)血矛線蟲為研究對象,對不同階段與不同蟲株的分泌產(chǎn)物進行Shotgun LC-MS/MS分析,以為揭示捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的侵染機理、免疫逃避等的研究提供基礎(chǔ)信息,并可為疫苗抗原、藥物靶點或診斷標(biāo)記的篩選提供新的思路,對今后捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的防治研究具有重要意義。具體研究成果如下:(1)研究確定糖鹽水漂浮法為捻轉(zhuǎn)血矛線蟲蟲卵的最佳分離方法,并通過對8種備選培養(yǎng)基的篩選,確定M199培養(yǎng)基為捻轉(zhuǎn)血矛線蟲體外培養(yǎng)的最適培養(yǎng)基。(2)通過對捻轉(zhuǎn)血矛線蟲培養(yǎng)條件的優(yōu)化和相應(yīng)指標(biāo)的測定發(fā)現(xiàn),在蟲體接種密度為30條時,標(biāo)準耐藥株和敏感株成蟲最佳培養(yǎng)條件為M199培養(yǎng)基700μL、青鏈霉素混合液(100×)300μL、兩性霉素B(2.5 mg/mL)20μL、伊維菌素(1 mg/mL)10 μL(僅耐藥株加入),分泌性蛋白質(zhì)最佳產(chǎn)生時間為75 h；其第三期脫鞘后幼蟲培養(yǎng)體系與成蟲一致,分泌性蛋白質(zhì)收集時間為10 d。(3)采用Shotgun LC-MS/MS技術(shù)對第三期脫鞘后幼蟲和成蟲分泌物進行分析,結(jié)果在Uniprot蛋白數(shù)據(jù)庫中共鑒定到分泌性蛋白質(zhì)161個,發(fā)現(xiàn)耐藥株特有蛋白質(zhì)為24個,其中P糖蛋白13、β微管蛋白和乙酰膽堿門控氯離子通道ACC-2與蟲體耐藥性相關(guān),敏感株特有蛋白質(zhì)為62個,敏感成蟲與耐藥成蟲共有蛋白質(zhì)為57個;功能分析表明,這些蛋白質(zhì)主要參與蛋白質(zhì)水解、代謝、轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)折疊、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、離子輸運、電子轉(zhuǎn)運與分子結(jié)合等過程。(4)對捻轉(zhuǎn)血矛線蟲分泌性蛋白質(zhì)的Western-blot檢驗顯示,分泌性蛋白質(zhì)大小在15 kDa～200 kDa不等,且不同蟲株和同株不同階段蟲體的分泌性蛋白質(zhì)之間確實存在差異,其中敏感蟲株的條帶較耐藥株多,成蟲較幼蟲多。
【圖文】：

注：表示差異顯著（ＰＣ０．０５）。逡逑進一步通過顯微鏡觀察三種方法所得蟲卵懸液中雜質(zhì)的情況，發(fā)現(xiàn)糖鹽水漂浮逡逑法所收集到的蟲卵回收率較高且所含雜質(zhì)較少（見圖１），鹽水離心法收集的蟲卵逡逑懸液雜質(zhì)較多，影響顯微鏡下對蟲卵的觀察（見圖２）；鹽水漂浮與糖鹽水漂浮結(jié)逡逑合法所得的蟲卵懸液較為干凈且雜質(zhì)很少，但其中蟲卵數(shù)量也較少（見圖３）。逡逑榦ｊ逡逑圖１糖鹽水漂浮法所獲蟲卵邐圖２鹽水離心法所獲蟲卵逡逑Ｆｉｇ．邋１邋Ｔｈｅ邋ｅｇｇｓ邋ｉｓｏｌａｔｅｄ邋ｂｙ邋ｔｈｅ邋ｆｌｏａｔｉｎｇ邋ｍｅｔｈｏｄ邋ｗｉｔｈ邋ｓｕｇａｒ邋ｂｒｉｎｅ邐Ｆｉｇ．２邋Ｔｈｅ邋ｅｇｇｓ邋ｉｓｏｌａｔｅｄ邋ｂｙ邋ｔｈｅ邋ｂｒｉｎｅ邋ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ邋ｍｅｔｈｏｄ逡逑

法所收集到的蟲卵回收率較高且所含雜質(zhì)較少（見圖１），鹽水離心法收集的蟲卵逡逑懸液雜質(zhì)較多，影響顯微鏡下對蟲卵的觀察（見圖２）；鹽水漂浮與糖鹽水漂浮結(jié)逡逑合法所得的蟲卵懸液較為干凈且雜質(zhì)很少，但其中蟲卵數(shù)量也較少（見圖３）。逡逑榦ｊ逡逑圖１糖鹽水漂浮法所獲蟲卵邐圖２鹽水離心法所獲蟲卵逡逑Ｆｉｇ．邋１邋Ｔｈｅ邋ｅｇｇｓ邋ｉｓｏｌａｔｅｄ邋ｂｙ邋ｔｈｅ邋ｆｌｏａｔｉｎｇ邋ｍｅｔｈｏｄ邋ｗｉｔｈ邋ｓｕｇａｒ邋ｂｒｉｎｅ邐Ｆｉｇ．２邋Ｔｈｅ邋ｅｇｇｓ邋ｉｓｏｌａｔｅｄ邋ｂｙ邋ｔｈｅ邋ｂｒｉｎｅ邋ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ邋ｍｅｔｈｏｄ逡逑
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S852.7

【參考文獻】

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1 周才瑛;王先坤;劉毅;劉偉;;瀏陽黑山羊捻轉(zhuǎn)血矛線蟲感染情況調(diào)查及pcox1基因分析[J];動物醫(yī)學(xué)進展;2015年09期

2 李軍燕;楊曉野;王瑞;楊蓮茹;鄧僑;羅曉平;;不同培養(yǎng)條件對捕食性真菌Duddingtonia flagrans生長的影響[J];中國獸醫(yī)學(xué)報;2015年06期

3 韓戰(zhàn)強;周居輝;孔雪旺;劉長春;李鵬偉;李進杰;;波爾山羊羔羊捻轉(zhuǎn)血矛線蟲與泰勒蟲混合感染診治[J];中國獸醫(yī)雜志;2014年06期

4 王瑞;張博倫;趙曉慧;楊曉野;楊蓮茹;李軍燕;馬亞囡;李文生;李秀霞;;捕食線蟲性真菌Duddingtonia flagrans胞外蛋白質(zhì)的產(chǎn)生及其殺蟲作用的研究[J];中國獸醫(yī)科學(xué);2014年04期

5 董建江;李雨來;;綿羊絲狀網(wǎng)尾線蟲、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲、結(jié)節(jié)蟲和疥螨混合感染癥的診治[J];養(yǎng)殖技術(shù)顧問;2013年09期

6 嚴若峰;徐立新;李祥瑞;;捻轉(zhuǎn)血矛線蟲純凈3期幼蟲制備方法的改進[J];畜牧與獸醫(yī);2009年01期

7 榮光;趙軍明;鄭金海;王新華;薄新文;鐘發(fā)剛;羅盤琪;任耀軍;;捻轉(zhuǎn)血矛線蟲蟲卵的大量分離純化[J];中國畜牧獸醫(yī);2008年12期

8 郝成;楊曉野;蔡蒸葵;王瑞;張曉東;韓海賓;孫玉卓;;幼蟲發(fā)育試驗對羊毛圓科線蟲抗藥性的檢測[J];中國獸醫(yī)寄生蟲病;2007年06期

9 姜波;楊光友;鄧家波;;動物線蟲抗藥機制研究進展[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2007年29期

10 菅復(fù)春;張龍現(xiàn);寧長申;趙金鳳;;獸醫(yī)臨床驅(qū)蟲藥及其應(yīng)用評價[J];中國畜牧獸醫(yī);2006年08期

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1 黃慧聰;廣州管圓線蟲感染免疫中ICOS-ICOSL通路及發(fā)育期蛋白的分析和研究[D];蘇州大學(xué);2013年

2 張紅麗;捻轉(zhuǎn)血矛線蟲滯育相關(guān)基因daf-22和hsp70全基因的獲得及其功能的研究[D];浙江大學(xué);2012年

3 韓凱凱;捻轉(zhuǎn)血矛線蟲甘油醛-3-磷酸脫氫酶DNA疫苗的免疫保護作用與烯醇化酶特性的研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

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1 孔令杰;呼倫貝爾草原部分地區(qū)綿羊消化道線蟲流行病學(xué)調(diào)查[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

2 高波;捻轉(zhuǎn)血矛線蟲六種酶蛋白體外對山羊外周血單個核細胞功能的影響[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

3 王晶晶;捻轉(zhuǎn)血矛線蟲肌動蛋白DNA疫苗的免疫保護性實驗與醛縮酶特性的研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

4 趙媛媛;捻轉(zhuǎn)血矛線蟲體外培養(yǎng)條件優(yōu)化和H11蛋白提取及氨肽酶活性分析[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

5 解曉鈺;博州地區(qū)羊消化道寄生蟲感染調(diào)查及冬季驅(qū)蟲試驗研究[D];新疆農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

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本文編號：2614228